基因敲除

基因敲除（knockout）是指一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。

指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機體的基因突變?；蚯度胗址Q基因置換，它是利用內(nèi)源基因序列兩側或外面的斷裂點，用同源序列的目的基因整個置換內(nèi)源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技術有Cre/Lox P系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。

步驟：

獲得干細胞

基因敲除一般應用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系逐漸被發(fā)展應用，最來自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干細胞系成功地用于基因敲除。由于這些遠交系遺傳背景復雜，所得到的模式小鼠往往不能得到重復性好的實驗結果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因為回交次數(shù)不一樣，也會造成實驗結果重復性差。這對生物科研，尤其是醫(yī)藥企業(yè)，安評中心，藥檢部門等，是一個很大的缺點。這對開發(fā)制作標準模式動物也是一個很大的缺陷。所以，如果能夠直接用C57BL/6 ES細胞進行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠種系等已經(jīng)廣泛的應用于免疫學，神經(jīng)學，癌癥，等幾乎所有研究領域。已經(jīng)有一些公司或科研機構已經(jīng)開始用C57BL/6遺傳背景的胚胎干細胞進行基因打靶。

載體構建

把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因基因打靶的目的不同，此載體有不同的設計方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點上，這種情況下應設計的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時所要設計的替換型打靶載體，應包括含有此靶基因的啟動子及外顯子的DNA片段及標記基因等諸成分。根據(jù)實驗目的不同，打靶載體分為全基因敲除，條件性基因敲除，基因敲進，誘導性基因敲除等打靶載體。

導入基因

將基因打靶載體通過一定的方式(常用電穿孔法)導入同源的胚胎干細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。

用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞

一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。由于用于TK篩選的Gancyclovir對小鼠的種系傳遞有影響，一般采用DTA(白喉毒素A亞基）進行陰性篩選。將篩選出來的靶細胞導入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人假孕母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。

性狀改變

通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學性狀的改變，達到研究目的基因的目的。

條件性基因敲除法 

條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。

條件性敲除的原理: 

利用Cre/LoxP 和來自酵母的FLP—frt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型。通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxP，并以此兩側裝接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 細胞產(chǎn)生“loxPfloxed”小鼠,然后，通過將“loxP floxed”小鼠與Cre 轉基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“loxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當它與Cre 轉基因小鼠雜交時，產(chǎn)生的子代中將同時帶有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表達產(chǎn)生的Cre 重組酶就會介導靶基因兩側的1oxP 間發(fā)生切除反應，結果將一個loxP 和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre 的表達為前提的。Cre 的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre 在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細胞；而Cre 的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。所以只要控制Cre 的表達特異性和表達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

誘導性基因敲除法 

誘導性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎，但卻是利用控制Cre 表達的啟動子的活性或所表達的Cre 酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre 基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在1oxP 動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導性類型如下：四環(huán)素誘導型(圖4)；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。

誘導性基因敲除優(yōu)點：

① 誘導基因突變的時間可人為控制； ② 可避免因基因突變而致死胎的問題 ③ 在2 個loxP 位點之間的重組率較高；  ④如用病毒或配體/DNA 復合物等基因轉移系統(tǒng)來介導Cre 的表達，則可省去建立攜帶Cre 的轉基因動物的過程。