背景及概述[1]

促性腺激素釋放激素，也稱作促黃體激素釋放激素(LHRH)，在下丘腦中合成。它是一種多肽荷爾蒙，其主要功能是使垂體釋放卵泡雌激素(FSH)和黃體化激素(LH)，可用于治療某些癌癥。目前應(yīng)用較多的用于治療癌癥的LHRH類似物主要有戈舍瑞林、曲普瑞林、亮丙瑞林等。其中戈舍瑞林是促性腺激素釋放激素人工合成十肽，被用于控制子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病的臨床癥狀和體征，預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后復(fù)發(fā)，均有良好的效果。長(zhǎng)期使用戈舍瑞林可抑制腦垂體生成素的合成，從而引起男性血清睪丸酮和女性血清雌二醇的下降，停藥后這一作用可逆，初期用藥時(shí)可暫時(shí)增加男性血清睪丸酮和女性血清雌二醇的濃度。

目前市售的戈舍瑞林緩釋制劑商品名(中文名諾雷得)是一種由阿斯利康開(kāi)發(fā)銷售的植入劑，1996年FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥為閉經(jīng)前的晚期乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥和前列腺癌。該制劑是一種直徑為1mm，長(zhǎng)度為3-6mm的棒狀顆粒，臨床使用時(shí)每月注射一次劑量：3.6mg/支，成人3.6mg每28日1次，作腹前壁皮下注射，其藥栓預(yù)置于一次性針筒內(nèi)，注射針頭相當(dāng)于16號(hào)穿刺針頭，長(zhǎng)度約30mm，因此與一般藥物皮下注射相比，注射時(shí)引起的疼痛程度要大，注射后導(dǎo)致皮下出血情況較多。鑒于醋酸戈舍瑞林的理化穩(wěn)定性及臨床適應(yīng)癥的用藥特點(diǎn)，患者常常需要長(zhǎng)期給藥，因此為了提高患者的順應(yīng)性，被開(kāi)發(fā)成長(zhǎng)效緩釋制劑是一個(gè)眾望所認(rèn)同的研究方向。而采用微球制劑比植入劑在為患者注射時(shí)，會(huì)大幅降低患者的疼痛及出血情況。目前上市的幾種LHRH類似物微球多為長(zhǎng)效緩釋制劑，其臨床使用的成功進(jìn)一步激發(fā)了醋酸戈舍瑞林微球的研發(fā)工作。目前就醋酸戈舍瑞林的合成方法就歸結(jié)于兩類，一種為固相合成方法一種為液相合成方法，但每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

規(guī)格[2]

注射埋植劑：3.6mg。

藥理作用[3]

本藥是一種合成的、促黃體生成素釋放激素的類似物，長(zhǎng)期使用可抑制垂體的促黃體生成激素的分泌，從而引起男性血清睪酮和女性血清雌二醇的下降，停藥后這一作用是可逆的。男性病人在次用藥之后21日左右，睪酮濃度可降低到去勢(shì)后的水平，在每28天用藥1次的治療過(guò)程中，睪酮濃度一直保持在去勢(shì)后的濃度范圍內(nèi)。這種睪酮抑制作用可使大多數(shù)病人的前列腺腫瘤消退，癥狀改善。女性患者在初次用藥后21日左右，血清雌二醇濃度受到抑制，并在以后每28天的治療中維持在絕經(jīng)后水平。這種抑制與激素依賴性的乳腺癌，子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)。

藥代動(dòng)力學(xué)[3]

本藥具有幾乎完全的生物利用度。每4周使用一注射埋植劑，可保持有效血藥濃度，而無(wú)組織蓄積。諾雷德的蛋白結(jié)合能力較差，在腎功能正常的情況下，血漿清除半衰期為2-4小時(shí)，腎功能不全病人的半衰期將會(huì)延長(zhǎng)，但對(duì)于每月都使用埋植劑的患者來(lái)說(shuō)，這影響非常小，故沒(méi)有必要改變這些病人的用量。在肝功能不全的病人中，藥代動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯的變化。

毒理研究[3]

在長(zhǎng)期重復(fù)使用諾雷德的雄性鼠中，曾觀察到良性腦垂體腫瘤的發(fā)病率上升，這一事實(shí)與以前已觀察到的行外科去勢(shì)后的大鼠的情形相似，但尚未發(fā)現(xiàn)與人體使用的經(jīng)驗(yàn)有任何關(guān)聯(lián)。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期重復(fù)使用數(shù)倍于人類常用劑量的諾雷德后，可發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞及幽門(mén)部胃粘膜細(xì)胞增生。這些事實(shí)與臨床的關(guān)系尚不清楚。

適應(yīng)證[2]

絕經(jīng)后乳腺癌，特別是他莫昔芬耐藥的患者。

用法用量[2]

①晚期前列腺癌的姑息治療。②治療絕經(jīng)前及圍絕經(jīng)期晚期乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位和子宮肌瘤。

不良反應(yīng)[2]

①內(nèi)分泌及代謝系統(tǒng)：常見(jiàn)面部發(fā)熱、潮紅。還可見(jiàn)乳房腫脹。此外，女性可見(jiàn)性欲降低、陰道干燥、月經(jīng)失調(diào)，男性可見(jiàn)陽(yáng)痿。②心血管系統(tǒng)：國(guó)外有轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者用藥后發(fā)生靜脈血栓的報(bào)道。③中樞神經(jīng)系統(tǒng)：可見(jiàn)頭痛，國(guó)外有用藥后出現(xiàn)硬膜外脊髓壓迫的報(bào)道。④消化系統(tǒng)：可見(jiàn)惡心，少見(jiàn)味覺(jué)障礙、腹瀉、腹痛、齒齦萎縮。⑤泌尿生殖系統(tǒng)：少數(shù)患者用藥早期可見(jiàn)血尿和尿道阻塞加重。國(guó)外偶有子宮肌瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的報(bào)道。⑥皮膚：可見(jiàn)皮疹、皮膚瘙癢、注射部位疼痛，個(gè)別可發(fā)生多軟骨炎。⑦骨骼：本藥治療前列腺癌開(kāi)始階段病情可加重，表現(xiàn)為骨痛加劇，有時(shí)可見(jiàn)下肢軟弱無(wú)力和感覺(jué)異常。

注意事項(xiàng)[2]

(1)慎用：①輸尿管梗阻引起腎損傷患者。②脊髓壓迫患者。③有引起骨礦物質(zhì)密度降低的治療史及危險(xiǎn)因素的患者。(2)常用的注射部位為上腹壁，但也可在下腹中線，可在注射前局部用麻醉劑。(3)男性晚期前列腺癌治療開(kāi)始時(shí)可并用氟他胺(Flutamide)。(4)戈舍瑞林10.8mg的植入制劑不適用于婦女。(5)每天給0.2～0.6mg的可樂(lè)定(Clonidine)可治療面部發(fā)熱的不良反應(yīng)。

制備[3]

醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，包括以下步驟：

步驟一、根據(jù)預(yù)設(shè)替代度sub（0.6mmol/g）=n（合成規(guī)模）/（X(裸2-CTCResin+n*M）氨基酸分子量這里指Fmoc-Pro-OH的分子量）可計(jì)算出X(裸2-CTCResinz的質(zhì)量)=266gFmoc-Pro-OH在合成樹(shù)脂的步驟中投料量為摩爾量的1.3倍即計(jì)算得出Fmoc-Pro-OH為87g將稱取替代度為1.1~1.3mmol/g的2-CTCResin266g（合成規(guī)模200mmol）加入反應(yīng)柱中同時(shí)加入3000mlDMF溶脹20min，溶脹后抽掉DMF，在加入3000mlDMF洗滌兩次，每次1min.將稱量好的Fmoc-Pro-OH87g在DMF/DCM的混合溶液中冰浴條件下加入摩爾量?jī)杀兜腄IPEA(N，N-二異丙基乙胺)的作用下，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間由所期待的替代度決定。反應(yīng)后處理DMF洗滌5次每次3000ml每次1min，然后加入3000ml封閉液（DCM：甲醇：DIPEA=80：15：5）封閉兩次每次10min得到sub=0.6mmol/g的Fmoc-Pro-CTCResin，加入3000ml20%DBLK（哌啶：DMF=1：4）去除Fmoc兩次，每次時(shí)間為10min待去除完畢后加入3000m的DMF洗滌兩次，得到H-Pro-CTCResin；這里所述Fmoc-Pro-OH和2-CTCResin的結(jié)構(gòu)式同權(quán)力要求說(shuō)明書(shū)步驟一。

步驟二、按照常規(guī)的固相合成方法，將步驟一中的脫完Fmoc的H-Pro-CTCResin用DMF洗滌4次，每次3000ml，洗滌時(shí)間1min，將稱量好Fmoc-Arg(NO2)-OH9(摩爾量的3倍)、和HOBT(摩爾量的3倍)投入反應(yīng)柱中補(bǔ)加DIC、反應(yīng)1h、待反應(yīng)完畢后取樹(shù)脂20-30粒用少量DMF洗滌兩遍進(jìn)行茚三酮檢測(cè)顯陽(yáng)性則表明反應(yīng)未完全需繼續(xù)反應(yīng)或是重復(fù)偶聯(lián)，若檢測(cè)顯陰性則表明反應(yīng)完全可進(jìn)行下一步的偶聯(lián)反應(yīng)，按以上步驟依次偶聯(lián)以下Fmoc保護(hù)的氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Tyr(Bzl)-OH得到Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTCResin；

步驟三、將Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTCResin加入3000mlDBLK去除Fmoc后DMF洗滌4次，每次3000ml，時(shí)間1min，加入稱量好HBTU（摩爾量的3倍）和Fmoc-Ser-OH(摩爾量的3倍)投入反應(yīng)柱中補(bǔ)加DIPEA和DCM使其攪拌均勻反應(yīng)10min抽掉反應(yīng)液加入DMF洗滌3次，每次3000ml，洗滌時(shí)間1min取樹(shù)脂20-30粒茚三酮檢測(cè)顯陽(yáng)性則表明反應(yīng)未完全需繼續(xù)反應(yīng)或是重復(fù)偶聯(lián)，若檢測(cè)顯陰性則表明反應(yīng)完全可進(jìn)行下一步的偶聯(lián)反應(yīng)按以上步驟偶聯(lián)Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTCResin；

步驟四、按照常規(guī)的固相合成方法同步驟二，采用HOBT/DIC、反應(yīng)1h、DMF作溶劑依次偶聯(lián)Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTCResin肽樹(shù)脂520g；

步驟五、按1：10（w：v）的樹(shù)脂與裂解液的比例配制全保護(hù)裂解液5200mL（V三氟乙醇：V二氯甲烷=1：4）加入到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-2-CTCResin肽樹(shù)脂中的攪拌反應(yīng)2h，待反應(yīng)完畢后過(guò)濾抽掉樹(shù)脂保留溶液目的去除其載體2-CTCResin；

步驟六、將全保護(hù)裂解液取出1ml作HPLC分析定位出峰時(shí)間1，然后再將其溶液用DIPEA（N，N-二異丙基乙胺）調(diào)成偏堿性PH=7.8-8.5優(yōu)選7.8-8.2按摩爾量的3倍將稱量好的鹽酸氨基脲和PyBop（1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián)劑）加入PH在7.8-8.2左右的全保護(hù)裂解液中進(jìn)行反應(yīng)偶聯(lián)，反應(yīng)時(shí)間1h，待反應(yīng)完畢后取出1ml同樣條件下作HPLC分析定位出峰時(shí)間2，然后根據(jù)峰型的變化及有無(wú)前移情況從而判斷跟蹤氨基脲的偶聯(lián)情況，如峰型有變化但反應(yīng)前的峰1沒(méi)有完全轉(zhuǎn)變到反應(yīng)1h后的峰2說(shuō)明還未反應(yīng)完全需繼續(xù)反應(yīng)，若反應(yīng)前的峰1完全轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)1h后的峰2說(shuō)明已經(jīng)反應(yīng)完全則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)最后得到保留側(cè)鏈保護(hù)基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2再將其溶液旋蒸濃縮1h后變?yōu)榈S色粘稠狀物；

步驟七、配置20%TFA/DCM的裂解液（v：v=1：4）緩慢加入到步驟六中的粘稠狀物中使其攪拌室溫裂解2h，再將其裂解液緩慢加入冰凍的乙醚中放置30min進(jìn)行沉降即得到去除His(Trt)上的側(cè)鏈保護(hù)基Trt前體肽IIPyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2320g

步驟八、將步驟七的白色固體粗肽真空抽干按1g/4ml用甲醇溶解溶解體積為1110ml，加入甲酸銨32g和Pa/c16g進(jìn)行氫化反應(yīng)去除肽序中側(cè)鏈保護(hù)基NO2和Bzl，從而得到戈舍瑞林粗肽Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2甲醇溶液；

步驟九、將步驟八的氫化反應(yīng)后的甲醇溶液過(guò)濾后得到995mL加入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體

步驟十、制備得到醋酸戈舍瑞林。

主要參考資料

[1] CN201710987598.1一種醋酸戈舍瑞林微球的制備方法

[2] 新編婦幼?？朴盟幩俨槭謨?cè)

[3] CN201510005951.2醋酸戈舍瑞林的固相合成方法