快速DNA連接試劑盒

快速DNA連接試劑盒(Rapid DNA Ligation Kit) 是信裕生物研發(fā)的一種把DNA片段在短至5-10分鐘內(nèi)快速插入到載體(vector)中的連接試劑盒。對于雙粘端DNA片段的插入僅需5-10分鐘即可完成，對于雙平端DNA片段的插入僅需15分鐘即可完成。同時本試劑盒也可以用于其它各種常規(guī)的雙鏈DNA連接反應(yīng)。連接30分鐘即可達到效果，與連接過夜的效果一致。
本試劑盒可以用于PCR片段和載體的連接、酶切產(chǎn)物和載體的連接、linker和載體的連接、linker和linker的連接等各種雙鏈DNA的連接。
為了獲得快速高效的連接效果，本試劑盒采用了一種特殊的高活力Rapid T4 DNA Ligase以及相應(yīng)的快速連接緩沖液，確保在短時間內(nèi)可以獲得很好的連接效果。連接30分鐘和連接過夜的效果相當，通常只須連接5-10分鐘即可滿足常規(guī)用途(圖1)。

圖1.快速DNA連接試劑盒實測效果圖。雙酶切后的載體室溫自連30min(A)或16℃自連過夜(D)作為陰性對照；雙酶切后的載體與待插入片段室溫連接10min(B)、30min(C)或者16℃連接過夜(E)，隨后轉(zhuǎn)化細菌涂板，并于第二天取平板觀察拍照。
在確保連接效果的同時，確保完成連接后不必進行任何純化即可直接轉(zhuǎn)化細菌。另外，快速連接緩沖液中已經(jīng)含有ATP、鎂離子等各種必需物質(zhì)，無需再添加其它任何試劑。
本試劑盒用于總體積為10μl的連接體系時可以進行100個連接反應(yīng)，用于總體積為20μl的連接體系時可以進行50個連接反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
連接反應(yīng)完成后即可直接轉(zhuǎn)化細菌，請勿采用加熱方法失活Rapid T4 DNA ligase。加熱處理會導(dǎo)致后續(xù)的轉(zhuǎn)化效率顯著下降。
對于載體單酶切插入外源片段的情況，需注意對載體進行脫磷處理，以避免質(zhì)粒自連。
快速連接緩沖液(2X)使用前一定要完全溶解并混勻，加入到連接體系后也須注意混勻。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. PCR產(chǎn)物或酶切片段和普通載體的連接：
a. 取1-2μg載體酶切過夜，或至少酶切3-5小時以上。盡量確保酶切充分，否則后續(xù)會導(dǎo)致產(chǎn)生很多自連的克隆。
b. 載體酶切完畢后，可以使用試劑盒進行純化，例如信裕生物的PCR純化試劑盒/DNA純化試劑盒(D0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。對于酶切產(chǎn)生較大片段(大于50-60bp)的情況推薦采用切膠回收的方式。
c. 對于PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的DNA片段。凝膠中DNA片段的回收可以使用試劑盒進行操作，例如信裕生物的DNA凝膠回收試劑盒(D0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收DNA片段。
d. 對于回收的PCR產(chǎn)物或其它需酶切的質(zhì)?；駾NA片段，用適當內(nèi)切酶酶切，隨后純化酶切產(chǎn)物。
注：這一步的酶切不必酶切特別充分，通常酶切效率能達到80-90%以上即可。即本步驟的酶切通常酶切1-2小時即可。酶切產(chǎn)物可以使用試劑盒進行純化，例如信裕生物的PCR純化試劑盒/DNA純化試劑盒(D0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。
e. 取約25-100ng經(jīng)過酶切和純化的載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體系。
注：很多時候由于載體量和待插入片段的量都比較少，在回收后很難定量。此時可以根據(jù)回收前電泳條帶的亮度進行大致的估計。通常以DNA分子量標準的某一條帶為參考，估計或通過灰度半定量您的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計的純化或凝膠回收時的得率計算出最終得到的載體量和待插入片段量的比例關(guān)系。

f. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
g. 室溫(25℃)孵育連接5-10分鐘或更長時間。對于雙平端連接需室溫(25℃)孵育15-30分鐘或更長時間。
注1：對于雙粘端連接：室溫孵育5-10分鐘通?？梢赃_到孵育更長時間所能達到連接效率的70%以上。室溫孵育30分鐘和16℃孵育過夜相比，無顯著差異。連接5-10分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒有準備好，完全可以適當延長連接時間。但通常不宜超過60分鐘。如果可能超過60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長時間甚至過夜。
注2：對于雙平端連接：室溫孵育15分鐘通常可以達到孵育更長時間所能達到連接效率的70%以上。室溫孵育60分鐘和16℃孵育過夜相比，無顯著差異。連接15分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒有準備好，完全可以適當延長連接時間。但通常不宜超過60分鐘。如果可能超過60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長時間甚至過夜。
注3：上述室溫連接效率的數(shù)據(jù)在25℃時獲得，在20-27℃時獲得的連接效率比較接近。室溫較低或較高時推薦在25℃水浴進行連接。
h. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。
2. PCR產(chǎn)物和T載體的連接：
a. PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的DNA片段。凝膠中DNA片段的回收可以使用試劑盒進行操作，例如信裕生物的DNA凝膠回收試劑盒(D0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收DNA片段。
b. 按照T載體的說明書取適量T載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體系。
注：很多時候由于載體量和PCR產(chǎn)物的量都比較少，在回收后很難定量。此時可以根據(jù)回收前電泳條帶的亮度進行大致的估計。通常以DNA分子量標準的某一條帶為參考，估計或通過灰度半定量您的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計的純化或凝膠回收時的得率計算出最終得到的載體量和PCR產(chǎn)物的量的比例關(guān)系。

c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d. 室溫孵育5-10分鐘或更長時間。
注：室溫孵育5-10分鐘通常可以達到孵育更長時間所能達到連接效率的70%以上。室溫孵育30分鐘和16℃孵育過夜相比，無顯著差異。連接5-10分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒有準備好，完全可以適當延長室溫的連接時間。但通常不宜超過60分鐘。如果可能超過60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長時間甚至過夜。
e. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。
3. Linker或RNAi片段和載體的連接：
a. 載體的酶切和純化同步驟1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以選擇適當?shù)腄NA退火緩沖液，例如信裕生物的Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 進行退火反應(yīng)。
c. 長度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和載體進行連接反應(yīng)。例如載體為0.03pmol，則插入片段可以為0.15至0.3pmol。長度小于8bp的linker，比例需調(diào)整為10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，隨后按照步驟1e-1h進行。
4. DNA自身環(huán)化的連接：
參考步驟1e，待插入片段換成適量的水即可。其余步驟按照步驟1f-1h進行。
5. 其它類型的DNA片段連接參考上述方法進行。

常見問題： 
1. 連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化效率很低或陽性克隆非常少。
a. 可能在加入快速連接緩沖液(2X)后沒有充分混勻。
b. 可能感受態(tài)細菌轉(zhuǎn)化效率太低，用質(zhì)粒作為陽性對照同時檢測感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率。
c. 可以嘗試提高載體或插入片段的純度。對于平端連接需注意適當延長連接時間。
d. 可能載體酶切不夠充分，用未經(jīng)連接的載體轉(zhuǎn)化作為陰性對照。
e. 用存放DNA的溶液進行轉(zhuǎn)化，作為陰性對照，檢測感受態(tài)細菌是否存在問題。