Klenow Fragment, Exo-

Klenow Fragment，Exo-，即沒有外切酶活性的Klenow片段，是大腸桿菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段
(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突變體。Klenow Fragment，Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但缺少完整
的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。
特點：由于Klenow Fragment，Exo-沒有外切酶活性，其在末端補平時經(jīng)常會在3'末端額外加上1個或多個核苷酸，因此不能用于產(chǎn)生平末端而用于后續(xù)的連接。
用途：5'突出末端的標(biāo)記；隨機引物法進(jìn)行DNA標(biāo)記；Sanger雙脫氧法進(jìn)行DNA測序等。 
來源：由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因的來源為突變的 polA 基因片段。
分子量：約68kDa(單體)。
活性定義：37℃30分鐘內(nèi)，催化10nmol脫氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定義為1個活性單位。
酶活性檢測條件：67mM potassium phosphate(pH7.4)，6.7mM MgCl₂，1mM 2-mercaptoethanol，0.033mM 
dATP，0.033mM dTTP，0.4MBq/ml[³H]-dTTP，62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
純度：不含DNA內(nèi)切酶，不含RNase。
酶儲存溶液：25mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃)，50mM MgCl₂， 10mM DTT。
緩沖液兼容性：在信裕生物的內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性為100%，在1X B、1X G中的活性為100%；在信裕生物的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反應(yīng)緩沖液中的活性為100%。
失活或抑制：75℃加熱10分鐘或加入適量EDTA均可導(dǎo)致Klenow Fragment，Exo-失活。金屬離子螯合劑，無機焦磷酸鹽(PPi)，大劑量的無機磷酸鹽(Pi)均對Klenow Fragment，Exo-有抑制作用。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項： 
酶使用時宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立即放置于-20℃保存。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 

使用說明：
1. 隨機引物法進(jìn)行DNA標(biāo)記：
a. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：

b. 按上表設(shè)置好反應(yīng)體系后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 對于random decamer primer，37℃孵育5分鐘；對于random hexamer primer，37℃孵育10分鐘。
d. 加入4μl 0.25mM dNTP，混勻后37℃孵育5分鐘。
e. 加入1μl 0.5M EDTA，pH8.0終止反應(yīng)。
f. 取1μl上述液體用于檢測標(biāo)記的效率。
g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它適當(dāng)試劑盒純化標(biāo)記好的探針。
2. 雙鏈DNA 5'突出(5'overhang)末端的標(biāo)記：
a. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：

b. 按上述體系配好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 30℃孵育15分鐘。
d. 75℃孵育10分鐘終止反應(yīng)。
3. 其他用途可以參考上述用途或適當(dāng)?shù)奈墨I(xiàn)資料進(jìn)行。