??????碧云天的離心柱式RNAeasy? Plus動(dòng)物RNA抽提試劑盒(RNAeasy? Plus Animal RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱法從動(dòng)物組織或培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質(zhì)量地抽提總RNA的試劑盒?？俁NA包括大于200個(gè)核苷酸的RNA(也常被稱為總RNA)和小于200個(gè)核苷酸的小RNA(small RNA)。
??????本試劑盒抽提得到的RNA可用于反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點(diǎn)雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實(shí)驗(yàn)；也可用于基因表達(dá)芯片分析(microarray)、高通量測(cè)序(high throughput sequencing)等對(duì)RNA質(zhì)量要求較高的情況。
??????碧云天的三款離心柱式及Trizol法RNA抽提試劑盒的主要特點(diǎn)和差異如下：

??????動(dòng)物組織或細(xì)胞中的RNA按照長(zhǎng)度可以分為長(zhǎng)鏈RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，長(zhǎng)鏈RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。長(zhǎng)鏈RNA按照是否編碼蛋白或多肽可以分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非編碼的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
??????本試劑盒抽提總RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA與小RNA，通過(guò)兩次特異性結(jié)合體系過(guò)同一純化柱，分別結(jié)合>200nt的RNA和<200nt的小RNA，同時(shí)有效避免了雜質(zhì)大量析出而阻塞純化柱，抽提得到包括>200nt的RNA和小RNA的總RNA，基因組DNA和蛋白等雜質(zhì)被有效去除，然后通過(guò)洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白等雜質(zhì)，最后用洗脫液將總RNA洗脫下來(lái)。

圖1. 離心柱式總RNA(>200nt的RNA和<200nt的小RNA)抽提流程示意圖

??????本試劑盒使用安全。本試劑盒通過(guò)特殊的柱純化介質(zhì)進(jìn)行總RNA分離純化，能有效避免傳統(tǒng)的Trizol法抽提時(shí)使用的酚、氯仿等有毒有害有機(jī)試劑。
??????本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無(wú)需繁瑣的RNA沉淀步驟，抽提操作過(guò)程僅25-30分鐘。相比于傳統(tǒng)的Trizol抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡(jiǎn)化，縮短了抽提時(shí)間，降低了RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。
??????本試劑盒抽提總RNA的得率高。本試劑盒的抽提效果經(jīng)反復(fù)測(cè)試，100萬(wàn)個(gè)凍存的HeLa細(xì)胞能抽提得到約15-20μg總RNA，5mg凍存的小鼠肝組織能抽提得到約6-10μg總RNA，5mg凍存的小鼠腎組織能抽提得到約3-5μg總RNA。不同來(lái)源的樣品可能有所差異，通常新鮮樣品的得率高于凍存樣品。本試劑盒的抽提效果參見(jiàn)圖2。

??????圖2. 本試劑盒總RNA抽提效果。樣品為凍存的50萬(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞、5mg小鼠肝組織和5mg小鼠腎組織。洗脫液用量均為40μl。均取6μl洗脫的樣品經(jīng)變性處理后，在含6.67%甲醛和適量NA-Red的1.2%變性瓊脂糖凝膠中電泳約45分鐘后拍照。抽提產(chǎn)物的得率依次為9.6μg、8.5μg和4.1μg，A260/A280依次為2.11、2.10和2.09，A260/A230依次為2.01、1.98和1.94。實(shí)際抽提效果會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

注：純的RNA其A260/A280約為2.0，但在很多儀器上測(cè)定時(shí)會(huì)高于2.0，低于1.9通常認(rèn)為有蛋白、DNA或者酚等的污染；純的RNA其A260/A230約為2.0左右或者略高，低于1.9通常認(rèn)為有碳水化合物、胍鹽、多肽或酚等的污染。
??????本試劑盒抽提得到的總RNA純度高，顯著優(yōu)于Trizol方法。抽提得到的總RNA的A260/A280通常為2.0-2.2。A260/A230通常為1.9-2.1。本試劑盒抽提獲得的RNA的實(shí)測(cè)純度參見(jiàn)圖2。
??????本試劑盒適用于新鮮或凍存的動(dòng)物組織或細(xì)胞總RNA與小RNA的抽提，推薦的細(xì)胞用量為50-100萬(wàn)，組織用量為3-5mg。
??????本試劑盒可用于50個(gè)樣品的總RNA(含小RNA)抽提。
包裝清單：

保存條件：
??????室溫保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
??????對(duì)于富含RNase的樣品(如動(dòng)物組織)，建議使用前在裂解液中添加二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)至終濃度為40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巰基乙醇至終濃度為1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巰基乙醇)，含DTT或β-巰基乙醇的裂解液可在室溫放置1個(gè)月。
??????通過(guò)本試劑盒抽提到的RNA已經(jīng)去除絕大多數(shù)DNA，通常情況無(wú)需DNase處理。后續(xù)如進(jìn)行某些對(duì)極少量DNA殘留較敏感的實(shí)驗(yàn)，則需要在使用說(shuō)明中步驟5離心后，在純化柱中加入適量DNase I (如80μl含10U DNase I的酶溶液，推薦使用碧云天的DNase I，D7076)，室溫消化15分鐘。消化結(jié)束后，不要離心，直接加入500μl洗滌液II，進(jìn)入使用說(shuō)明的步驟6進(jìn)行操作。
??????本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時(shí)應(yīng)小心，避免被污染。所有自行準(zhǔn)備的試劑和耗材也都應(yīng)是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時(shí)應(yīng)避免對(duì)著樣品或所使用的試劑盒耗材呼氣或說(shuō)話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
??????對(duì)于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用碧云天生產(chǎn)的RNase and DNase Away (R0123)以去除實(shí)驗(yàn)桌面上或其它接觸面上的RNase。
??????使用凍存的細(xì)胞或組織抽提RNA的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因?yàn)樵诩?xì)胞或組織凍融過(guò)程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的RNase會(huì)被釋放出來(lái)并剪切樣品中的RNA。對(duì)于組織樣品，推薦使用碧云天生產(chǎn)的RNALater?動(dòng)物組織RNA穩(wěn)定保存液(R0118)進(jìn)行保存以保證樣品RNA的完整性。
??????本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無(wú)需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
??????廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
??????結(jié)合液I、II和洗滌液II中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關(guān)規(guī)范進(jìn)行存放和使用。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。