細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào):RTG2401)
● 試劑盒內(nèi)容及保存:
● 儲(chǔ)存條件和效期:
本試劑盒在室溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年;更長時(shí)間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下,若溶液產(chǎn)生沉淀,應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的蛋白酶K、溶菌酶和RNaseA收到后-20℃保存。
● 產(chǎn)品簡介:
本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)提取細(xì)菌(革蘭氏陽性菌和陰性菌)的基因組DNA。溶菌酶能有效去除細(xì)菌細(xì)胞壁;蛋白酶K能把核酸解離出來; RNaseA能去除痕量的RNA污染;離心吸附柱能夠高效、專一吸附DNA,限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物,提取的基因組DNA片段大,純度高,質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。
● 提取得率:
● 準(zhǔn)備工作:
1. 準(zhǔn)備55℃和70℃水??;無水乙醇;1.5ml滅菌離心管。
2. 按照標(biāo)簽所示在去蛋白液GD和漂洗液GW中加入無水乙醇,混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液GA,緩沖液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成,如果出現(xiàn)沉淀,37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 操作步驟:
如非指出,所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1. 取細(xì)菌培養(yǎng)液1–2 ml,10,000 g離心1分鐘,盡量吸凈上清;向細(xì)菌沉淀中加入180μl EB,旋渦混勻后加入18μl 溶菌酶,室溫放置10-15分鐘,期間間歇混勻幾次。
注:溶菌酶的用量和處理時(shí)間與處理的細(xì)菌種類密切相關(guān),用戶可以根據(jù)細(xì)菌種類進(jìn)行調(diào)節(jié)。如革蘭氏陽性菌應(yīng)將處理時(shí)間延長到30-60
分鐘。
2.10,000g離心1分鐘,吸棄大部分上清,留下約10 μl液體,徹底混勻。
注:由于余留的液體較少,徹底混勻菌體不太容易,用手指彈動(dòng)管壁附加槍頭反復(fù)吹打既能完全混勻菌體?;靹蛞欢ㄒ獜氐?,否則容易導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。
3. 向菌體沉淀中加入200 μl緩沖液GA,混勻。
4. 向管中加入20 μl 蛋白酶K,混勻,55℃處理15-30分鐘,期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。
注:加入蛋白酶K后會(huì)產(chǎn)生絮狀物,消化徹底的標(biāo)志是絮狀物完全消失,溶液變清亮。如消化不徹底,會(huì)導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。
5. 加入10 μl RNaseA(10 mg/ml)溶液,混勻后室溫放置2分鐘。
6. 加入220 μl緩沖液GB,混勻,70℃放置10-30分鐘(對(duì)于革蘭氏陽性菌,時(shí)間應(yīng)延長到60分鐘)。
注:加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀,一般70℃放置相應(yīng)時(shí)間后溶液會(huì)變清亮。如溶液未變清亮,應(yīng)延長70℃處理時(shí)間。如果絮狀物不能處理干凈,容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。
7. 加入220 μl無水乙醇,充分混勻。
注:加入乙醇后會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀,可用槍頭反復(fù)抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理,容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。
8. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中),11,000g離心5分鐘,倒掉廢液,吸附柱CG放入收集管中。
注:如果出現(xiàn)吸附柱堵塞現(xiàn)象,可將離心時(shí)間延長到10分鐘。
9. 向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),11,000 g離心2分鐘,倒掉廢液,吸附柱放入收集管中。
10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液GW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),11,000 g離心60秒,倒掉廢液,吸附柱放入收集管中。
11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液GW,11,000 g離心60秒,倒掉廢液。
12. 吸附柱CG放回收集管中,11,000 g離心2分鐘。
注:此步驟非常重要,其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。
13. 將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,11,000 g離心2分鐘。
注;① 洗脫緩沖液體積不少于50 μl,體積過小影響回收效率。
② 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。
14. DNA產(chǎn)物-20℃保存。
● DNA濃度及純度檢測:
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度??膳渲?.8-1.0%瓊脂糖凝膠,使用λ/HindIII判斷基因組的大小,完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測時(shí), OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間,如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水洗脫,比值可能偏低,但并不表明DNA純度不高。
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