細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：RTG2401）

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的蛋白酶K、溶菌酶和RNaseA收到后-20℃保存。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)提取細(xì)菌（革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌）的基因組DNA。溶菌酶能有效去除細(xì)菌細(xì)胞壁；蛋白酶K能把核酸解離出來(lái)； RNaseA能去除痕量的RNA污染；離心吸附柱能夠高效、專一吸附DNA，限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。

● 提取得率：

● 準(zhǔn)備工作：

1. 準(zhǔn)備55℃和70℃水浴；無(wú)水乙醇；1.5ml滅菌離心管。

2. 按照標(biāo)簽所示在去蛋白液GD和漂洗液GW中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1. 取細(xì)菌培養(yǎng)液1–2 ml，10,000 g離心1分鐘，盡量吸凈上清；向細(xì)菌沉淀中加入180μl EB，旋渦混勻后加入18μl 溶菌酶，室溫放置10-15分鐘，期間間歇混勻幾次。

注：溶菌酶的用量和處理時(shí)間與處理的細(xì)菌種類密切相關(guān)，用戶可以根據(jù)細(xì)菌種類進(jìn)行調(diào)節(jié)。如革蘭氏陽(yáng)性菌應(yīng)將處理時(shí)間延長(zhǎng)到30-60

分鐘。

2.10,000g離心1分鐘，吸棄大部分上清，留下約10 μl液體，徹底混勻。

   注：由于余留的液體較少，徹底混勻菌體不太容易，用手指彈動(dòng)管壁附加槍頭反復(fù)吹打既能完全混勻菌體。混勻一定要徹底，否則容易導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。

3. 向菌體沉淀中加入200 μl緩沖液GA，混勻。

4. 向管中加入20 μl 蛋白酶K，混勻，55℃處理15-30分鐘，期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。

   注：加入蛋白酶K后會(huì)產(chǎn)生絮狀物，消化徹底的標(biāo)志是絮狀物完全消失，溶液變清亮。如消化不徹底，會(huì)導(dǎo)致步驟8中離心柱堵塞。

5. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

6. 加入220 μl緩沖液GB，混勻，70℃放置10-30分鐘（對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)到60分鐘）。

注：加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置相應(yīng)時(shí)間后溶液會(huì)變清亮。如溶液未變清亮，應(yīng)延長(zhǎng)70℃處理時(shí)間。如果絮狀物不能處理干凈，容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。

7. 加入220 μl無(wú)水乙醇，充分混勻。

注：加入乙醇后會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀，可用槍頭反復(fù)抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理，容易導(dǎo)致步驟8中離心柱的堵塞。

8. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g離心5分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

注：如果出現(xiàn)吸附柱堵塞現(xiàn)象，可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到10分鐘。

9. 向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000 g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液GW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000 g離心60秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液GW，11,000 g離心60秒，倒掉廢液。

12. 吸附柱CG放回收集管中，11,000 g離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。

13. 將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11,000 g離心2分鐘。

注；① 洗脫緩沖液體積不少于50 μl，體積過(guò)小影響回收效率。

② 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

14. DNA產(chǎn)物-20℃保存。

● DNA濃度及純度檢測(cè)：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。