我公司的組織細胞microRNA(miRNA)提取試劑盒提取小RNA(＜200nt)具有操作步驟簡單、重復性、產(chǎn)率較高的特點。核酸提取的成功與否、提取質(zhì)量的好壞對后續(xù)實驗起著至關重要的作用。使用TRIzol試劑提取總RNA，對總RNA中包含的部分小RNA進行研究，該方法的缺點是總RNA中microRNA的比例較小，同時由于mRNA的干擾，會導致后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和RealTime PCR實驗效率很低，很難獲得理想的實驗結果，且結果不可靠。為此，在探索miRNA分子功能的過程中開發(fā)了本試劑盒，使用該試劑盒提取的RNA中，長度在15～200nt范圍的RNA在95%以上，基本不含有大RNA和DNA。使用該試劑通過一步上柱即可獲得高純度小RNA，可在45分鐘內(nèi)完成miRNA的提取。該試劑盒廣泛適用于動物組織、細胞和多糖多酚含量不高的植物組織樣本。

產(chǎn)品組成：

儲存：室溫可保存2年。
注意：miRNA Reagent A溶液中含有胍鹽，其具有強烈的腐蝕性，試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等防護措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。

樣本量及產(chǎn)量預期：

操作方法：
一、組織樣本提取
1．向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物組織則再加入10μl β-巰基乙醇，混合均勻。
2．在液氮條件下充分將組織研磨粉碎，將一定的樣品量（見樣本使用量表）研磨成粉狀的組織加入到上述300μl miRNAReagent A中，立即手腕用力震蕩至組織粉末徹底溶解于裂解液中。室溫靜置 5分鐘 以充分裂解細胞。
  注意：將組織加入到 miRNA Reagent A 后要迅速將組織震散，否則易引起組織成團狀，不容易裂解。如發(fā)生成團狀，務必用移液器將團狀組織吹打松散。
3．向上述裂解完畢的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13000rpm離心5分鐘，吸取550μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中。
4．向上述溶液中加入200μl無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置 5分鐘。
5．13000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。
7．分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
9．向吸附柱中加入500μl無水乙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
10．吸附柱 13000rpm 空離心2分鐘，去掉殘留的乙醇。
11．將吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室溫放置 2分鐘，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室溫靜置 2分鐘，13000rpm離心2分鐘，洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNA。（通常取1～2μl該產(chǎn)物，即可使用我司一步法 miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，貨號：MT0006）。
二、細胞樣本提取
1．貼壁細胞：胰酶消化細胞后，離心收集細胞沉淀。用100μl的1×PBS 重懸細胞后，加入300μl miRNA Reagent A顛倒混合均勻，室溫放置 5分鐘。
2．懸浮細胞：直接離心后，收集細胞沉淀。用100μl 1×PBS重懸細胞后，加入300μl miRNA Reagent A顛倒混合均勻，室溫放置 5分鐘。
3．向上述裂解完畢的裂解液中加入250μl miRNA ReagentB，上下顛倒混合均勻。13000rpm離心5分鐘，吸取550μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中。
  注意：加入細胞體積數(shù)與miRNA Reagent B總體積數(shù)為350μl。如加入50μl細胞，則miRNA Reagent B使用300μl。
4．向上述550μl上清溶液中加入200μl無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置 5分鐘。
5．13000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。
7．分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
9．向吸附柱中加入500μl無水乙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。
10．吸附柱 13000rpm 空離心2分鐘，去掉殘留的乙醇。
11．將吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室溫放置 2分鐘，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室溫靜置 2分鐘，13000rpm離心2分鐘，洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNA。（通常取1～2μl該產(chǎn)物，即可使用我司一步法 miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，貨號：MT0006）。


圖例：小鼠肌肉組織的小RNA提取
 A1-A2：TRIzol試劑
 B1-B2：A公司microRNA提取試劑
 C1-C2：我司miRNA提取試劑盒。

常見問題：
1．本方法提取的小RNA，95％以上為小RNA（<200nt），有時會殘留一些>200nt的RNA，通常殘留的>200nt RNA不影響后續(xù)試驗操作。
2．本試劑盒提取的小RNA由于不含mRNA等大分子量的RNA，因此更適合做后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗，從而進行定量試驗。
3．使用本試劑盒提取的miRNA濃度通常在50ng/μl左右，取5～10μl即可用于電泳檢測。取1～2μl即可用于我司TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應（貨號：MT0006），并使用我司優(yōu)化的miRNA-TaqMan RealTime PCR技術（貨號：MTTxxxxx）。