地塞米松對(duì)細(xì)胞因子刺激的人眼球后成纖維細(xì)胞的影響
地塞米松對(duì)宮頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用
曾建華1,鐘 玲1,徐 波2 (1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶400010;2深圳市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科,深圳518028)
摘 要:目的 探討超生理劑量的地塞米松對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。方法 5~6周齡雌性BALB/c裸鼠皮下接種傳代培養(yǎng)的HeLa腫瘤細(xì)胞,腫瘤長大后(接種后16 d)每天腹腔內(nèi)注射超生理劑量的地塞米松(62·5 mg·kg-1·d-1),連續(xù)10 d,測(cè)量腫瘤直徑,計(jì)算腫瘤體積及抑瘤率;對(duì)腫瘤進(jìn)行透射電鏡觀察、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)。結(jié)果 超生理劑量的地塞米松體內(nèi)注射能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;與對(duì)照組相比,治療組腫瘤體積變小[(1. 472±0. 082) cm3vs(0·383±0. 038) cm3,P<0. 01],抑瘤率為73. 99%,凋亡小體數(shù)目增多[(413±87)個(gè)vs(160±101)個(gè),P<0. 01)],VEGF灰度值降低[(172. 833±12·978)vs(177·067±6. 875),P<0. 01],TNF-α灰度值無差異[(172. 833±12. 978)vs(177. 067±6. 875),P>0. 05]。結(jié)論 超生理劑量的地塞米松體內(nèi)用藥能顯著抑制腫瘤生長,與誘導(dǎo)凋亡及抑制VEGF
有關(guān),而與TNF-α無關(guān)。
關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;地塞米松;凋亡;血管內(nèi)皮生長因子;腫瘤壞死因子
中圖法分類號(hào):R73-351;R977. 11;R737. 33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
Dexamethasone inhibits cervical carcinoma cell xenografted tumors in nudem ice
ZENG Jian-hua1,ZHONG Ling1,XU Bo2(1Department ofObstetrics and Gynecology,The Second Affiliated Hospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400010;2Department ofObstetrics and Gynecology,ShenzhenWomen and Children’sHospital,Shenzhen518028,China)
Abstract:Objective To investigate the effects of over physiological dose of dexamethasone on cervicalcarcinoma cell xenografted tumors in nude mouse.Methods HeLa cells were inoculated subcutaneously inBALB/c femalemice aged 5-6weeks. verphysiologicaldose ofdexamethasone(62. 5mg·kg-1·d-1)wasinjected into the peritoneum from the 16th day after inoculation for10 d. Diameters of tumorweremeasured every two or three days.The volumes and the inhibition rates of tumorwere calculated. Apoptotic bodieswere observed by transmission electronmicroscopy and counted byTUNEL. VEGF andTNF-αwere detected by immunohistochemistry.Results In vivo,over physiological dose ofdexamethasone can repress the growth of tumorand induce cell apoptosis. Comparedwith the controlgroup,the tumor sizeswere significantly smaller(P<0.01)with 73. 99% inhibition rates,the numberofapoptotic bodieswere significantly increased(P<0. 01)andVEGFwere reduced(P<0. 01). Butno differencewas found between the two groups inTNF-α(P>0. 05).Conclusion Over physiological dose ofdexamethasone can repress cervical tumor growthin vivo. This actionmay be related to apoptosis andVEGF,buthave no relationshipwithTNF-α.
Key words:cervical carcinoma;dexamethasone;cell apoptosis;VEGF;TNF-α
糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的類固醇類激素,有重要的生理學(xué)作用,主要影響糖和蛋白質(zhì)代謝。超生理劑量糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗毒、抗免疫、抗休克及抗水腫作用。地塞米松治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得了可喜成績(jī)。體外研究已證明:地塞米松可誘1導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞凋亡[1],對(duì)卵巢癌3AO細(xì)胞、卵巢癌HO-8910細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯增殖抑制作用[2-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:地塞米松對(duì)小鼠進(jìn)展期肺腺癌有抗腫瘤作用[5],大劑量地塞米松有加強(qiáng)順鉑抗小鼠埃利希氏腹水癌作用[6]。給小鼠肝癌細(xì)胞株H22腫瘤模型腹腔注射地塞米松,給藥組的瘤重和最終瘤體積與對(duì)照組比較顯著減小,顯著抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞株H22腫瘤的生長[7]。本實(shí)驗(yàn)通過裸鼠移植瘤模型進(jìn)一步研究地塞米松對(duì)宮頸癌生長的影響及機(jī)制。
1 材料與方法
1. 1 藥品、試劑及儀器
地塞米松磷酸鈉注射液(批號(hào)2005080139),購于西南藥業(yè)股份有限公司。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL試劑盒,Cat. No. 11684817910)購于羅氏公司,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒、SABC免疫組化試劑盒、S-P免疫組化試劑盒(批號(hào)51282108)及DAB顯色劑(批號(hào)50781680)購于博士德生物工程有限公司。儀器為HI-TACHI-H-7500透射電子顯微鏡。
1. 2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞,由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)室惠贈(zèng)。常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、接種。
1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
5~6周齡雌性BALB/c裸鼠12只,體質(zhì)量(16. 5±1. 4)g。清潔級(jí)動(dòng)物,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào): SCXK(京)2002-2003,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代養(yǎng)。
1. 4 動(dòng)物模型的建立及處理
每只裸鼠右腋下近背部皮下接種HeLa細(xì)胞0. 3 ml(1×108/ml)。從接種第4天成瘤后開始用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑,每2~3天1次,計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(V)=長×寬2/2。用藥前采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B兩組,每組6只。A組:為對(duì)照組,每天腹腔內(nèi)注入0. 4 ml生理鹽水; B組:地塞米松劑量為每只每天1 mg(62. 5 mg·kg-1·d-1),從接種后第16天開始經(jīng)腹腔內(nèi)注入0. 4 ml地塞米松溶液,每天1次,連用10 d,停藥后24 h處死,采集腫瘤標(biāo)本。
1. 5 計(jì)算抑瘤率
抑瘤率(% )=(1?VT/VC)×100%,VT為用藥組平均體
積,VC為對(duì)照組平均體積。
1. 6 標(biāo)本處理
腫瘤標(biāo)本經(jīng)3. 5%戊二醛固定送電鏡觀察,經(jīng)10%多聚甲醛固定送HE染色及TUNEL、VEGF及TNF-α免疫組化檢查。以不加TUNEL、VEGF及TNF-α試劑為陰性對(duì)照。
1. 6. 1 TUNEL 每例標(biāo)本于凋亡小體陽性較多處照相5張,經(jīng)北航醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)(4. 0版)處理后,以平均的凋亡小體數(shù)目作為一個(gè)標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)量。
1. 6. 2 TNF-α 采用SABC法, DAB顯色。每張切片分別從上、下、左、右及中間觀察5個(gè)不連續(xù)的高倍視野(×400),經(jīng)北航醫(yī)學(xué)病理圖像處理系統(tǒng)處理后平均灰度值作為一個(gè)標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)量。
1. 6. 3 VEGF 采用S-P法, DAB顯色。每張切片分別從上、下、左、右及中間觀察5個(gè)不連續(xù)的高倍視野(×400),經(jīng)北航醫(yī)學(xué)病理圖像處理系統(tǒng)(4. 0版)處理后平均灰度值作為一個(gè)標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)量。
1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 10. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行小樣本均數(shù)t檢驗(yàn)
2 結(jié)果
2. 1 一般情況
全部裸鼠都有腫瘤生長,成瘤率100%。腫瘤標(biāo)本經(jīng)HE染色檢查均有腫瘤生長。
2. 2 腫瘤體積
接種約3 d后腫瘤逐漸增大,用藥后腫瘤的生長速度較對(duì)照組變慢,體積也較小,兩組比較有顯著性差異[t=29. 455,P<0. 01; (1. 472±0. 082) cm3vs(0. 383±0. 038) cm3]。以A組為對(duì)照,B組的腫瘤抑瘤率為73. 99%。
2. 3 電鏡下凋亡小體觀察
A組無早期凋亡表現(xiàn),亦無凋亡小體形成(圖1A);而B組則有較多凋亡小體形成(圖1B),形態(tài)上有明顯差異。
A:A組;B:B組
圖1 腫瘤組織電鏡圖
2.4 TUNEL檢測(cè)凋亡小體數(shù)目結(jié)果
腫瘤組織行TUNEL檢測(cè)均有凋亡小體存在(圖2)。A組數(shù)目少,而B組凋亡小體數(shù)目較多,兩組比較有顯著性差異[t=4.631,P<0.01;(413±87)個(gè)vs(160±101)個(gè)]。
2.5 VEGF灰度值
用藥后VEGF的平均灰度值降低(圖3),與A組比較有顯著性差異[t=3.780,P<0.01; (174.883±11.565)vs(198.517±10.038)]。
2.6 TNF-α灰度值
B組與A組的平均灰度值比較無差異性(圖4)[t=0·706,P>0.05; (172.833±12.978)vs(177.067±6.875)]。
3 討論
3.1 地塞米松抑制宮頸癌裸鼠移植瘤的生長 近幾年來,腫瘤化療取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步,特別是對(duì)白血病、惡性淋巴瘤等的治療有了突破,腫瘤患者生存時(shí)間明顯延長,但對(duì)危害人類生命健康最嚴(yán)重的、占惡性腫瘤90%以上的實(shí)體瘤的治療未能達(dá)到滿意的效果。因此,如何提高對(duì)實(shí)體瘤的療效是醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)解決的迫切任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)研究了地塞米松對(duì)宮頸癌實(shí)體瘤的影響,研究顯示,超生理劑量地塞米松作用于裸鼠宮頸癌移植瘤,其腫瘤體積顯著小于對(duì)照組,腫瘤抑瘤率為73.99%,表明地塞米松顯著抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長(P<0.01),與Zhang等[8]認(rèn)為的地塞米松對(duì)實(shí)體瘤治療無效的結(jié)論并不一致,這可能與地塞米松劑量有關(guān),生理劑量無抗腫瘤作用,超生理劑量地
塞米松才有抗腫瘤作用。
3.2 地塞米松抑制宮頸腫瘤生長的可能機(jī)制
藥物對(duì)腫瘤的抑制作用包括多個(gè)方面。誘導(dǎo)腫瘤1281細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤組織新生血管生成是抑制腫瘤生長的主要機(jī)制[9,10]。資料顯示,糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是受體依賴性的[11]。糖皮質(zhì)激素通過簡(jiǎn)單擴(kuò)散與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的激素-受體復(fù)合物結(jié)合,由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)移位,是外界刺激信息傳遞至細(xì)胞核、轉(zhuǎn)化成細(xì)胞效應(yīng)的信號(hào)通路的關(guān)鍵組成,參與細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育和腫瘤形成。超生理劑量的地塞米松與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)要素的DNA受體位點(diǎn)結(jié)合后,受體的構(gòu)象發(fā)生改變,激素-受體復(fù)合物與激素反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)或抑制糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞停止于G1期[12],最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而抑制腫瘤生長。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)地塞米松治療后,腫瘤組織HE染色及透射電鏡檢查無明顯組織細(xì)胞變性壞死,在電鏡觀察及TUNEL檢測(cè)主要存在凋亡小體,并且凋亡小體形態(tài)及數(shù)目與對(duì)照組有明顯差異,表明地
塞米松抑制宮頸腫瘤生長的機(jī)制之一可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。
腫瘤血管的形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成[10]。VEGF亦稱血管滲透因子,陽性標(biāo)記位于胞質(zhì)中,是最重要也是最具有代表性的血管生長因子,是一種對(duì)血管生長有強(qiáng)誘導(dǎo)作用且是目前所知的唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種生長因子,它的生物學(xué)特性與實(shí)性腫瘤的生長密切相關(guān),VEGF的高表達(dá)可刺激腫瘤血管的形成,與血管生成和腫瘤生長相輔相成、相互依賴,導(dǎo)致腫瘤血管無限制地?cái)U(kuò)增,使腫瘤細(xì)胞無節(jié)制地生長,促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。抑制VEGF的生成則可抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。有資料表明,地塞米松抑制小鼠肝癌細(xì)胞系H22腫瘤組織VEGF-mRNA的表達(dá)及微血管生成[14]。使用VEGF抗體抑制腫瘤血管生成,
抑制腫瘤細(xì)胞的生長,現(xiàn)已成為研究腫瘤治療中的熱點(diǎn)之一。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)超生理劑量地塞米松治療后,VEGF的平均灰度值較對(duì)照組顯著降低(P<0.01),表明地塞米松抑制宮頸腫瘤生長的另一機(jī)制可能是通過抑制VEGF的表達(dá),從而抑制新生血管的
生成,與翟羽等報(bào)道的地塞米松抑制肝癌細(xì)胞株H22腫瘤生長和抗血管生成有關(guān)基本一致。
本研究還探索了地塞米松對(duì)宮頸癌TNF-α的影響。TNF-α是目前已知具有多功能性的細(xì)胞因子之一,具有廣泛的生物學(xué)特性,對(duì)腫瘤有雙重生物學(xué)效應(yīng)。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)地塞米松治療后,用藥組與對(duì)照組的TNF-α平均灰度值比較無升高及降低(P>0.05),表明地塞米松抑制宮頸癌生長與TNF-α無關(guān)。這可能與TNF-α對(duì)腫瘤的雙重生物學(xué)效應(yīng)有關(guān),既有抗腫瘤作用,又可促進(jìn)腫瘤生長或轉(zhuǎn)移[15]。
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