地塞米松對細胞因子刺激的人眼球后成纖維細胞的影響
地塞米松對宮頸癌細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用
曾建華1,鐘 玲1,徐 波2 (1重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶400010;2深圳市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科,深圳518028)
摘 要:目的 探討超生理劑量的地塞米松對宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤生長的影響。方法 5~6周齡雌性BALB/c裸鼠皮下接種傳代培養(yǎng)的HeLa腫瘤細胞,腫瘤長大后(接種后16 d)每天腹腔內(nèi)注射超生理劑量的地塞米松(62·5 mg·kg-1·d-1),連續(xù)10 d,測量腫瘤直徑,計算腫瘤體積及抑瘤率;對腫瘤進行透射電鏡觀察、原位細胞凋亡檢測(TUNEL)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測。結(jié)果 超生理劑量的地塞米松體內(nèi)注射能抑制宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤生長,誘導腫瘤細胞凋亡;與對照組相比,治療組腫瘤體積變小[(1. 472±0. 082) cm3vs(0·383±0. 038) cm3,P<0. 01],抑瘤率為73. 99%,凋亡小體數(shù)目增多[(413±87)個vs(160±101)個,P<0. 01)],VEGF灰度值降低[(172. 833±12·978)vs(177·067±6. 875),P<0. 01],TNF-α灰度值無差異[(172. 833±12. 978)vs(177. 067±6. 875),P>0. 05]。結(jié)論 超生理劑量的地塞米松體內(nèi)用藥能顯著抑制腫瘤生長,與誘導凋亡及抑制VEGF
有關(guān),而與TNF-α無關(guān)。
關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;地塞米松;凋亡;血管內(nèi)皮生長因子;腫瘤壞死因子
中圖法分類號:R73-351;R977. 11;R737. 33 文獻標識碼:A
Dexamethasone inhibits cervical carcinoma cell xenografted tumors in nudem ice
ZENG Jian-hua1,ZHONG Ling1,XU Bo2(1Department ofObstetrics and Gynecology,The Second Affiliated Hospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400010;2Department ofObstetrics and Gynecology,ShenzhenWomen and Children’sHospital,Shenzhen518028,China)
Abstract:Objective To investigate the effects of over physiological dose of dexamethasone on cervicalcarcinoma cell xenografted tumors in nude mouse.Methods HeLa cells were inoculated subcutaneously inBALB/c femalemice aged 5-6weeks. verphysiologicaldose ofdexamethasone(62. 5mg·kg-1·d-1)wasinjected into the peritoneum from the 16th day after inoculation for10 d. Diameters of tumorweremeasured every two or three days.The volumes and the inhibition rates of tumorwere calculated. Apoptotic bodieswere observed by transmission electronmicroscopy and counted byTUNEL. VEGF andTNF-αwere detected by immunohistochemistry.Results In vivo,over physiological dose ofdexamethasone can repress the growth of tumorand induce cell apoptosis. Comparedwith the controlgroup,the tumor sizeswere significantly smaller(P<0.01)with 73. 99% inhibition rates,the numberofapoptotic bodieswere significantly increased(P<0. 01)andVEGFwere reduced(P<0. 01). Butno differencewas found between the two groups inTNF-α(P>0. 05).Conclusion Over physiological dose ofdexamethasone can repress cervical tumor growthin vivo. This actionmay be related to apoptosis andVEGF,buthave no relationshipwithTNF-α.
Key words:cervical carcinoma;dexamethasone;cell apoptosis;VEGF;TNF-α
糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的類固醇類激素,有重要的生理學作用,主要影響糖和蛋白質(zhì)代謝。超生理劑量糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗毒、抗免疫、抗休克及抗水腫作用。地塞米松治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得了可喜成績。體外研究已證明:地塞米松可誘1導人宮頸癌細胞株HeLa細胞凋亡[1],對卵巢癌3AO細胞、卵巢癌HO-8910細胞、乳腺癌MCF-7細胞有明顯增殖抑制作用[2-4]。動物實驗表明:地塞米松對小鼠進展期肺腺癌有抗腫瘤作用[5],大劑量地塞米松有加強順鉑抗小鼠埃利希氏腹水癌作用[6]。給小鼠肝癌細胞株H22腫瘤模型腹腔注射地塞米松,給藥組的瘤重和最終瘤體積與對照組比較顯著減小,顯著抑制體內(nèi)肝癌細胞株H22腫瘤的生長[7]。本實驗通過裸鼠移植瘤模型進一步研究地塞米松對宮頸癌生長的影響及機制。
1 材料與方法
1. 1 藥品、試劑及儀器
地塞米松磷酸鈉注射液(批號2005080139),購于西南藥業(yè)股份有限公司。原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL試劑盒,Cat. No. 11684817910)購于羅氏公司,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒、SABC免疫組化試劑盒、S-P免疫組化試劑盒(批號51282108)及DAB顯色劑(批號50781680)購于博士德生物工程有限公司。儀器為HI-TACHI-H-7500透射電子顯微鏡。
1. 2 實驗細胞
人宮頸癌細胞株HeLa細胞,由重慶醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞培養(yǎng)室惠贈。常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、接種。
1. 3 實驗動物
5~6周齡雌性BALB/c裸鼠12只,體質(zhì)量(16. 5±1. 4)g。清潔級動物,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號: SCXK(京)2002-2003,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心代養(yǎng)。
1. 4 動物模型的建立及處理
每只裸鼠右腋下近背部皮下接種HeLa細胞0. 3 ml(1×108/ml)。從接種第4天成瘤后開始用游標卡尺測量腫瘤直徑,每2~3天1次,計算腫瘤體積。腫瘤體積(V)=長×寬2/2。用藥前采用隨機數(shù)字表法分為A、B兩組,每組6只。A組:為對照組,每天腹腔內(nèi)注入0. 4 ml生理鹽水; B組:地塞米松劑量為每只每天1 mg(62. 5 mg·kg-1·d-1),從接種后第16天開始經(jīng)腹腔內(nèi)注入0. 4 ml地塞米松溶液,每天1次,連用10 d,停藥后24 h處死,采集腫瘤標本。
1. 5 計算抑瘤率
抑瘤率(% )=(1?VT/VC)×100%,VT為用藥組平均體
積,VC為對照組平均體積。
1. 6 標本處理
腫瘤標本經(jīng)3. 5%戊二醛固定送電鏡觀察,經(jīng)10%多聚甲醛固定送HE染色及TUNEL、VEGF及TNF-α免疫組化檢查。以不加TUNEL、VEGF及TNF-α試劑為陰性對照。
1. 6. 1 TUNEL 每例標本于凋亡小體陽性較多處照相5張,經(jīng)北航醫(yī)學圖像處理系統(tǒng)(4. 0版)處理后,以平均的凋亡小體數(shù)目作為一個標本的統(tǒng)計量。
1. 6. 2 TNF-α 采用SABC法, DAB顯色。每張切片分別從上、下、左、右及中間觀察5個不連續(xù)的高倍視野(×400),經(jīng)北航醫(yī)學病理圖像處理系統(tǒng)處理后平均灰度值作為一個標本的統(tǒng)計量。
1. 6. 3 VEGF 采用S-P法, DAB顯色。每張切片分別從上、下、左、右及中間觀察5個不連續(xù)的高倍視野(×400),經(jīng)北航醫(yī)學病理圖像處理系統(tǒng)(4. 0版)處理后平均灰度值作為一個標本的統(tǒng)計量。
1. 7 統(tǒng)計學分析
采用SPSS 10. 0統(tǒng)計軟件進行小樣本均數(shù)t檢驗
2 結(jié)果
2. 1 一般情況
全部裸鼠都有腫瘤生長,成瘤率100%。腫瘤標本經(jīng)HE染色檢查均有腫瘤生長。
2. 2 腫瘤體積
接種約3 d后腫瘤逐漸增大,用藥后腫瘤的生長速度較對照組變慢,體積也較小,兩組比較有顯著性差異[t=29. 455,P<0. 01; (1. 472±0. 082) cm3vs(0. 383±0. 038) cm3]。以A組為對照,B組的腫瘤抑瘤率為73. 99%。
2. 3 電鏡下凋亡小體觀察
A組無早期凋亡表現(xiàn),亦無凋亡小體形成(圖1A);而B組則有較多凋亡小體形成(圖1B),形態(tài)上有明顯差異。
A:A組;B:B組
圖1 腫瘤組織電鏡圖
2.4 TUNEL檢測凋亡小體數(shù)目結(jié)果
腫瘤組織行TUNEL檢測均有凋亡小體存在(圖2)。A組數(shù)目少,而B組凋亡小體數(shù)目較多,兩組比較有顯著性差異[t=4.631,P<0.01;(413±87)個vs(160±101)個]。
2.5 VEGF灰度值
用藥后VEGF的平均灰度值降低(圖3),與A組比較有顯著性差異[t=3.780,P<0.01; (174.883±11.565)vs(198.517±10.038)]。
2.6 TNF-α灰度值
B組與A組的平均灰度值比較無差異性(圖4)[t=0·706,P>0.05; (172.833±12.978)vs(177.067±6.875)]。
3 討論
3.1 地塞米松抑制宮頸癌裸鼠移植瘤的生長 近幾年來,腫瘤化療取得了相當?shù)倪M步,特別是對白血病、惡性淋巴瘤等的治療有了突破,腫瘤患者生存時間明顯延長,但對危害人類生命健康最嚴重的、占惡性腫瘤90%以上的實體瘤的治療未能達到滿意的效果。因此,如何提高對實體瘤的療效是醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)解決的迫切任務(wù)。本實驗研究了地塞米松對宮頸癌實體瘤的影響,研究顯示,超生理劑量地塞米松作用于裸鼠宮頸癌移植瘤,其腫瘤體積顯著小于對照組,腫瘤抑瘤率為73.99%,表明地塞米松顯著抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長(P<0.01),與Zhang等[8]認為的地塞米松對實體瘤治療無效的結(jié)論并不一致,這可能與地塞米松劑量有關(guān),生理劑量無抗腫瘤作用,超生理劑量地
塞米松才有抗腫瘤作用。
3.2 地塞米松抑制宮頸腫瘤生長的可能機制
藥物對腫瘤的抑制作用包括多個方面。誘導腫瘤1281細胞凋亡、抑制腫瘤組織新生血管生成是抑制腫瘤生長的主要機制[9,10]。資料顯示,糖皮質(zhì)激素誘導的細胞凋亡是受體依賴性的[11]。糖皮質(zhì)激素通過簡單擴散與細胞質(zhì)內(nèi)的激素-受體復(fù)合物結(jié)合,由細胞質(zhì)向細胞核內(nèi)移位,是外界刺激信息傳遞至細胞核、轉(zhuǎn)化成細胞效應(yīng)的信號通路的關(guān)鍵組成,參與細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育和腫瘤形成。超生理劑量的地塞米松與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)要素的DNA受體位點結(jié)合后,受體的構(gòu)象發(fā)生改變,激素-受體復(fù)合物與激素反應(yīng)元件結(jié)合,誘導或抑制糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄,使細胞停止于G1期[12],最終使細胞發(fā)生凋亡,從而抑制腫瘤生長。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)地塞米松治療后,腫瘤組織HE染色及透射電鏡檢查無明顯組織細胞變性壞死,在電鏡觀察及TUNEL檢測主要存在凋亡小體,并且凋亡小體形態(tài)及數(shù)目與對照組有明顯差異,表明地
塞米松抑制宮頸腫瘤生長的機制之一可能通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用。
腫瘤血管的形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成[10]。VEGF亦稱血管滲透因子,陽性標記位于胞質(zhì)中,是最重要也是最具有代表性的血管生長因子,是一種對血管生長有強誘導作用且是目前所知的唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的一種生長因子,它的生物學特性與實性腫瘤的生長密切相關(guān),VEGF的高表達可刺激腫瘤血管的形成,與血管生成和腫瘤生長相輔相成、相互依賴,導致腫瘤血管無限制地擴增,使腫瘤細胞無節(jié)制地生長,促進惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[13]。抑制VEGF的生成則可抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。有資料表明,地塞米松抑制小鼠肝癌細胞系H22腫瘤組織VEGF-mRNA的表達及微血管生成[14]。使用VEGF抗體抑制腫瘤血管生成,
抑制腫瘤細胞的生長,現(xiàn)已成為研究腫瘤治療中的熱點之一。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)超生理劑量地塞米松治療后,VEGF的平均灰度值較對照組顯著降低(P<0.01),表明地塞米松抑制宮頸腫瘤生長的另一機制可能是通過抑制VEGF的表達,從而抑制新生血管的
生成,與翟羽等報道的地塞米松抑制肝癌細胞株H22腫瘤生長和抗血管生成有關(guān)基本一致。
本研究還探索了地塞米松對宮頸癌TNF-α的影響。TNF-α是目前已知具有多功能性的細胞因子之一,具有廣泛的生物學特性,對腫瘤有雙重生物學效應(yīng)。本研究顯示,宮頸腫瘤經(jīng)地塞米松治療后,用藥組與對照組的TNF-α平均灰度值比較無升高及降低(P>0.05),表明地塞米松抑制宮頸癌生長與TNF-α無關(guān)。這可能與TNF-α對腫瘤的雙重生物學效應(yīng)有關(guān),既有抗腫瘤作用,又可促進腫瘤生長或轉(zhuǎn)移[15]。
參考文獻:
[1]徐 波,顧美禮,卞度宏.地塞米松體外誘導宮頸癌細胞株凋亡及其機制的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2003,12(3):176-178.
[2]徐明娟,崔 英,方國恩,等.糖皮質(zhì)激素對人卵巢癌細胞系(3AO)的誘導分化作用[J].上海醫(yī)學,2003,26(4):265-267.
[3]陳玉霞,李宗斌,刁 飛,等.地塞米松抑制人卵巢癌細胞HO-8910增殖的分子機制:RhoB信號通路的作用[J].中華醫(yī)學雜志,2006,86(20):1400-1404.
[4]徐明娟,惠 寧,劉宇健.地塞米松對人乳腺癌細胞系MCF-7細胞增殖及細胞周期的影響[ J].第二軍醫(yī)大學學報,2005,26(9):1015-1017.
[5] Al-WadeiHA,TakahasiT, SchullerHM. PKA-dependentgrowth stimulation of cells derived from human pulmonary adenocarcinoma andsmall airway epithelium by dexamethasone[J].Eur JCancer,2005,41(17):2745-2753.
[6] ArafaHM, Abdel-HamidM A, El-Khouly A A,et al. Enhancementby dexamethasone of the therapeutic benefitsofcisplatinviaregulation oftumor angiogenesis and cell cycle kinetics in a murine tumor paradigm[J]. Toxicology,2006,222(1-2):103-113.
[7]翟 羽,侯 潔,蔡月花.地塞米松對小鼠H22腫瘤生長及血管生成的抑制作用[J].中國比較醫(yī)學雜志,2004,14(1):16-19.
[8] ZhangC, Beckermann B, KallifatidisG,et al. Corticosteroids inducechemotherapy resistance in the majority of tumour cells from bone,brain, breast, cervix, melanoma and neuroblastoma [J]. Int JOnco,l
2006,29(5):1295-1301.
[9] Bose R, VerheijM, Haimovitz-Friedman A,et al. Ceramide synthasemediates daunorubicin-induced apoptosis: an alternative mechanism forgenerating death signals [J].Cel,l1995,82(3):405-414.
[10]李春海,李克勤.腫瘤微血管生成的機制與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[J].中華腫瘤雜志,2000,22(3):181-183.
[11] Cidlowski JA,King K L, Evans-Storms R B,et al. The biochemistryand molecular biology of glucocorticoid-induced apoptosis in the im-mune system[J].RecentProgHorm Res,1996,51:457-491.
[12] Chou R H,HuangH. Restoration of p53tumor suppressor pathway inhuman cervical carcinoma cells by sodium arsenite[J]. Biochem Biop yResCommune,2002,293(1):298-306.
[13] Grunstein J, RobertsW G, Mathieu-Costello O,et al. Tumor-derived
expression of vascular endothelial growth factor is a critical factor in
tumor expansion and vascular function [ J]. Cancer Res,1999,59(7):1592-1598.
[14]翟 羽,呂占軍.地塞米松對小鼠H22腫瘤生長及血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J].腫瘤防治研究,2003,30(2):98-101.
[15] Giraudo E, PrimoL, AuderoE,etal.Tumornecrosis factor-alpha reg-ulates expression ofvascular endothelialgrowth factor receptor-2and ofits co-receptor neuropilin-1in human vascular endothelial cells [J]. JBiolChem,1998,273(34):22128-22135.