HIV-1病毒為正鏈RNA病毒，基于HIV-1病毒改造來(lái)的慢病毒載體（Lentiviral vector）系統(tǒng)，能有效感染非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞，將載體中所攜帶的目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，使之隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂，目的基因能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)。除腫瘤細(xì)胞外，大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體能夠感染那些其它載體難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞，能介導(dǎo)所包含的目的基因在腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組織或細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)。因此，人們常用慢病毒載體將熒光素酶基因或其它目的基因?qū)雽?shí)驗(yàn)動(dòng)物、原代細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系。

本公司自行研發(fā)的專門標(biāo)記干細(xì)胞的GFP/mCherry-熒光素酶雙報(bào)告慢病毒載體包裝試劑盒，將慢病毒載體包裝過程中的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)，如載體構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)化和優(yōu)化，并濃縮成簡(jiǎn)單的試劑盒，方便了操作，也提高了效率。高效的包裝系統(tǒng)，優(yōu)化的轉(zhuǎn)染技術(shù)，最專業(yè)的技術(shù)支持，努力使您能方便地應(yīng)用慢病毒載體技術(shù)為活體成像的應(yīng)用提供支撐。

這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問題：
● 用GFP/mCherry-熒光素酶基因雙報(bào)告慢病毒系統(tǒng)穩(wěn)定感染各種細(xì)胞，能大大提高熒光蛋白和熒光素酶基因的表達(dá)效率。

●提供方便的雙標(biāo)記系統(tǒng)，擴(kuò)大了活體成像技術(shù)在干細(xì)胞和腫瘤等方面的研究和應(yīng)用。

優(yōu)勢(shì)：

• 高效的感染：包裝的病毒系統(tǒng)可侵染最多的細(xì)胞類型，包括非分化細(xì)胞和難以轉(zhuǎn)染細(xì)胞（原代、血、干細(xì)胞）。
• 表達(dá)穩(wěn)定，可遺傳：包裝基因整合到基因組DNA上，高水平表達(dá)，低變異。
• 不干擾細(xì)胞：細(xì)胞功能不受侵染過程影響。
• 生物安全：三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝的安全性；非人源HIV 病毒限度降低風(fēng)險(xiǎn)。
• 高包裝效率：病毒包裝時(shí)采用的轉(zhuǎn)染試劑提供系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率接近100%。
• 完整的病毒包裝體系：提供載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、病毒濃縮和純化、滴度檢測(cè)等病毒包裝產(chǎn)品。程度的降低包裝繁瑣程度，提供包裝病毒產(chǎn)品。此外，本系統(tǒng)同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和熒光素酶雙報(bào)告基因，即可通過熒光顯微鏡直接觀察感染效率，也可通過流式細(xì)胞術(shù)直接分選感染細(xì)胞，可方便的通過活體成像儀跟蹤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，為干細(xì)胞和腫瘤等研究提供了便捷的體外觀察和活體成像工具。

本公司熒光素酶慢病毒載體包裝試劑盒由二部分組成：

  1. 慢病毒上清液400μl，病毒滴度6×10⁷

  2. 轉(zhuǎn)染試劑Polybrene（1000×，10ul）

篩選標(biāo)記：Hygromycin

實(shí)驗(yàn)過程：

慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。本試劑盒包括了所有的轉(zhuǎn)錄并包裝目的基因到重組的慢病毒載體所需要的所有輔助蛋白。您可以將慢病毒上清液直接用于干細(xì)胞的感染，熒光素酶基因進(jìn)入到干細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)熒光素酶等效應(yīng)分子。

常見問題解答:

1.     我們用的包裝系統(tǒng)效率遠(yuǎn)高于Invitrogen的系統(tǒng)，具體圖譜沒有電子版本，基本結(jié)構(gòu)差不多，但比Invitrogen的多了cPPT和WPRE，因此包裝效率高了很多。

2.     質(zhì)粒混合物有三種載體組成，其中包括一個(gè)熒光素酶表達(dá)載體，另兩個(gè)是慢病毒包裝載體，三種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，在細(xì)胞中重組為慢病毒，并分泌至培養(yǎng)上清中，一般滴度在5×10⁶左右。病毒可以濃縮，我們可提供專用的病毒濃縮液，但要想達(dá)到10¹⁰的話，則需要包裝100盤250px左右的細(xì)胞然后濃縮，工作量和花費(fèi)都很巨大。

3.     轉(zhuǎn)染效率，對(duì)于人類腫瘤細(xì)胞來(lái)說是90%左右，整合到基因組里穩(wěn)定表達(dá)的幾率是10%左右；對(duì)于一般方法很難轉(zhuǎn)染的鼠源性的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是50%左右。

4.     100μl病毒上清液的病毒滴度是5×10⁶—1×10⁷之間。

5.     50μl的病毒上清液可用12孔板轉(zhuǎn)染，12孔板每孔感染時(shí)細(xì)胞量為2×10⁵，每孔需要加入的病毒上清液是20-50μl（需根據(jù)具體細(xì)胞調(diào)整），100μl最多可感染5個(gè)孔。病毒感染時(shí)盡量采用較少的培養(yǎng)基，如12孔每孔加500μl即可；Polybrene按1:1000加入，感染12小時(shí)后換液常規(guī)培養(yǎng)。

6.     包裝好的病毒上清液在3天之內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建議不反復(fù)凍存。否則在一凍一溶的過程中，病毒滴度會(huì)降低一半，病毒活性也會(huì)降低。

7.     在轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，換用無(wú)血清培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染試劑Polybrene（1000×,1ml培養(yǎng)基加0.5ul）,搖勻，轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)換有血清培養(yǎng)基。

8.  細(xì)胞的篩選：轉(zhuǎn)染后的48-72小時(shí)加入篩選藥物Hygromycin（100ug/ul）,每毫升培養(yǎng)基加3-5ul, 24h換液。細(xì)胞對(duì)潮霉素的反應(yīng)比較敏感，一般處理24小時(shí)后撤藥，細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后再做同樣處理，根據(jù)需要處理2-3次即可，切不可持續(xù)給藥！否則細(xì)胞會(huì)全部死亡。潮霉素一般用潮霉素B，沒有廠家區(qū)別，質(zhì)量一般都有保證。以后細(xì)胞逐漸由24孔板傳至12孔板、6孔板、150px盤、250px盤中培養(yǎng)。

9.  細(xì)胞的鑒定：取5×10⁴細(xì)胞鋪入24孔板，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。

10.轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的MOI值建議梯度為50倍、75倍、100倍。按照MOI值100計(jì)算的話，2×10⁷病毒量可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)是20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。使用24孔板，每孔1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的話，可以轉(zhuǎn)20個(gè)孔。

11.  本試劑盒具有很高的轉(zhuǎn)染效率，在95%以上。對(duì)于干細(xì)胞，可以選擇不加Hygromycin篩選，通過熒光蛋白進(jìn)行流式檢測(cè)和分選。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，很難掌握合適的Hygromycin篩選壓力，造成實(shí)驗(yàn)的麻煩。如果因?qū)嶒?yàn)需要，必須加Hygromycin篩選，建議先用未標(biāo)記的干細(xì)胞進(jìn)行耐受劑量的摸索，切勿直接用標(biāo)記過的干細(xì)胞進(jìn)行劑量摸索，免得損失標(biāo)記過的干細(xì)胞。

12.  絕大多數(shù)細(xì)胞感染慢病毒后生長(zhǎng)特性不變，也有少數(shù)細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后增殖變慢，可考慮重新感染建系。