Cell Counting Kit-8

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存：4℃避光保存，一年有效。-20℃保存，兩年有效，但反復(fù)凍融會增加背景值，干擾實驗測定，因此請將經(jīng)常使用的試劑保存在4℃。

產(chǎn)品說明：

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8），是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒。

CCK-8試劑中含有WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）是一種類似于MTT的化合物，它在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在條件下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物Formazan（參考圖1），生成的Formazan數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。

圖1. WST-8檢測原理圖 (EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑)

金克隆CCK-8試劑盒具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、線性范圍寬、數(shù)據(jù)可靠、重現(xiàn)性好等特點，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

操作步驟（僅供參考）：

制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量時）

1. 制備細胞懸液：細胞計數(shù)。

2. 接種到96孔板中：按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做5-7個細胞濃度梯度，每組3-6個重復(fù)孔。每孔約100μl細胞懸液。

3. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4. 每孔加入10μl CCK-8增強型溶液：由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?/span>10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

5. 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4h后測定450nm吸光度，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(X軸)，吸光度為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。）

細胞活性檢測

1. 制備細胞懸液：細胞計數(shù)。

2. 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100μl細胞懸液，可設(shè)置3-6個重復(fù)孔。

3. 37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h。

4. 每孔加入10μl CCK-8增強型溶液：由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

5. 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時。

6. 測定450nm吸光度：如果暫時不測定吸光度可以向每孔中加入10μl自己配制的0.1M HCl溶液或1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

細胞增殖-毒性檢測

1. 制備細胞懸液：細胞計數(shù)。

2. 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100μl細胞懸液，可設(shè)置3-6個重復(fù)孔。

3. 37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h。也可以根據(jù)實驗要求的不同，培養(yǎng)相應(yīng)的時間。

4. 每孔加入0-10μl不同濃度的待測藥物。

5. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入待測藥物的培養(yǎng)時間，要看該物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性，一般要根據(jù)細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。

6. 每孔加入10μl CCK-8增強型溶液：由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含10% CCK-8

的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。（注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基，以去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。）

7. 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0.5-4小時：細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣，對于大多數(shù)情況孵育1小時即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

8. 測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。如果暫時不測定吸光度，可以向每孔中加入10μl自己配制的0.1M HCl溶液或1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

計算公式

細胞存活率 = [(As - Ab)／(Ac - Ab)] ×100%

抑制率 = [(Ac - As)／(Ac - Ab)] ×100%

As：實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測藥物）的吸光度

Ac：對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測藥物）的吸光度

Ab：空白孔（不含細胞和待測藥物的培養(yǎng)基、CCK-8）的吸光度

注意事項：

1. 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

2. CCK-8反應(yīng)時間的確定：一般情況下，白細胞顯色比較困難，因此需要增加細胞數(shù)量和延長CCK-8反應(yīng)時間。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色，因此懸浮細胞在加入CCK-8培養(yǎng)0.5-4小時后，可先從培養(yǎng)箱取出，目測或用酶標儀測定顯色程度，若顯色困難可以繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后再確定。對于貼壁細胞，CCK-8的培養(yǎng)時間一般為0.5-4小時，在培養(yǎng)20分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度。

3. 每孔接種細胞數(shù)：當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔 (100μl培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔 (100 μl培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

4. 設(shè)定空白對照：在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

5. 影響CCK-8測定的物質(zhì)： 由于CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應(yīng)，所以如果待測體系中存在氧化還原物質(zhì)則可能會干擾檢測結(jié)果，還原性物質(zhì)會使吸光度增加，氧化性物質(zhì)會使吸光度減小，因此應(yīng)需設(shè)法去除這些物質(zhì)的影響。酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除只含有培養(yǎng)基的對照孔中本底吸光度而消除，因此不會對檢測結(jié)果造成影響。

6. 測定波長：如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450nm，參比波長600-650nm。如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm檢測靈敏度最高。

7. 當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

8. 如細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測。

9. 為了您的安全和健康，操作時請穿著實驗服并佩戴一次性手套。

CCK-8 法與其它檢測方法之間的比較：

表1. 增殖/毒性測定試劑的比較