輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP+和NADPH含量測(cè)定可以計(jì)算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。
測(cè)定原理：
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm下檢測(cè)吸光值，從而測(cè)定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測(cè)NADP+含量。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
堿性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，-20 ℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；
試劑四：粉劑×1支，4 ℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；
試劑五：液體1.8mL×1支，4 ℃保存；
試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；
試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。
NADP+和NADPH的提?。?/span>
1 血清（漿）中NADP+和NADPH的提取
NADP+的提?。喊凑昭澹{）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADPH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2組織中NADP+和NADPH的提?。?/span>
NADP+的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADPH的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3 細(xì)胞或細(xì)菌中NADP+和NADPH的提?。?/span>
NADP+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADPH的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：
試劑名稱(μL) 對(duì)照管 測(cè)定管
樣本 50 50
試劑一 250 250
試劑二 75 75
試劑三 75 75
試劑四 75 75
試劑五 35 35
試劑六 500 混勻，室溫避光靜置20min
試劑六 500
充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：
試劑七 1000 1000
混勻，570nm下比色，讀取對(duì)照吸光值A1和測(cè)定管吸光值A2，計(jì)算△A=A2-A1。
注意事項(xiàng)：
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。
3、反應(yīng)過程中注意避光。
4、若NADP+測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量較
低，已低于檢測(cè)限，可做如下調(diào)整：（1）將測(cè)定管避光靜置時(shí)間20min延長(zhǎng)到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。
5、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒50管保證測(cè)24個(gè)NADP+或NADPH。
NADP+和NADPH含量的計(jì)算：
（一）NADP+含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中y為△A，x為NADP+濃度nmol/mL
1、血清（漿）中NADP+含量計(jì)算
NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP+含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NADP+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144）
（二）NADPH含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中y為△A，x為NADPH濃度nmol/mL
1、血清（漿）中NADPH含量計(jì)算
NADPH含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPH含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
注意：最低檢測(cè)限為0.01nmol/mL或0.01nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot
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上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實(shí)業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽(yù)”的精神，堅(jiān)持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽(yù)為國(guó)內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
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