NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒說明書

                                  分光光度法 50管/48樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒測定意義：

NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯一催化NADP⁺降解為NAD⁺的酶，與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。

測定原理：

NADPase能夠催化NADP⁺水解為NAD+和無機磷的反應，通過測定無機磷的量來測定NADPase活性。

所需的儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30 mL×1瓶， 4℃保存。

試劑二：粉劑×5支，-20℃保存；用時每支加入1 mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑五：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑六：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑六20倍稀釋，即取 0.5mL試劑六加9.5蒸餾水，充分混勻。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑

              應為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注 意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣本的前處理：

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒操作步驟：

1、酶促反應

37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱5min

37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確反應30min后，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

2、定磷

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值。

注意事項：

1、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格，要沒有一點磷，若試管放過磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來水沖，最后用蒸餾水沖干凈。用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測成敗的關鍵。

2、標準管、空白管和對照管只要做一次即可。

NADPase酶活性計算： 

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算： 

定義：每小時每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h/g鮮重)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）×

V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，0.5小時；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。