胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒說明書
分光光度法 50管/48樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒測定意義：
ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸，同時還原NADP+生成NADPH。ICDHc是細胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化。
測定原理：
利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應(yīng)，在340 nm下測定NADPH濃度的增加。
所需的儀器和用品:
紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，4℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；
樣本的前處理：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒測定步驟：
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱10min左右；用不完的試劑4℃保存。
3、 在試劑三中加入550μL蒸餾水充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱10min左右；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
4、 在試劑四中加入550μL蒸餾水充分溶解，置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱10min左右；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
5、 操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 |
試劑一 | 750 |
試劑三 | 10 |
試劑四 | 10 |
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；混勻，在340nm波長下記錄20s時的初始吸光度A1和2min20s時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。
注意事項：
1、 若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
2、 若A2-A1小于0.005，可延長反應(yīng)時間到5min或10min。
ICDHc活力單位的計算：
1、血清（漿）ICDHc活力的計算:
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=2143×ΔA
2、組織、細菌或細胞中ICDHc活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=2143×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min /104）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=4.285×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： 胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒;胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒;
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