使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)是體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基石。它可以提高您研究的精確度和可重復(fù)性，并提高結(jié)果的可靠性。無(wú)論您的研究重點(diǎn)是微生物學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)還是其他疾病，如果涉及細(xì)胞培養(yǎng)，則使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行準(zhǔn)確的手動(dòng)計(jì)數(shù)至關(guān)重要。
該方案涵蓋了如何使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，從準(zhǔn)備樣品到使用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活力，以便您可以放心地使用實(shí)驗(yàn)中的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。
第 1 階段 準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器
1.如果使用玻璃血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和蓋玻片，請(qǐng)?jiān)谑褂们坝镁凭逑?。用水?rùn)濕蓋玻片并固定在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。
2.如果使用一次性血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，只需在使用前從包裝中取出即可。
第 2 階段 制備細(xì)胞懸浮液
表 1. 胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞所需的DPBS和胰蛋白酶-EDTA的量。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，確保細(xì)胞分布均勻。
2.在細(xì)胞沉淀之前，用5 mL無(wú)菌移液器取出0.5 mL細(xì)胞懸浮液，放入EP微量離心管中。
3.取100 µL細(xì)胞放入新的EP離心管中，并添加400 µL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)（最終濃度0.32%），輕輕攪拌。
第3階段 計(jì)數(shù)
實(shí)驗(yàn)步驟
1.使用移液器吸取100 µL經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)處理的細(xì)胞懸浮液，加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中。
如果使用玻璃血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，則非常輕柔地將蓋玻片下方的兩個(gè)腔室填充，以便通過(guò)毛細(xì)管作用將細(xì)胞懸浮液抽出。
如果使用一次性血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，將細(xì)胞懸浮液吸入計(jì)數(shù)室的孔中，利用毛細(xì)管作用將其吸入內(nèi)部。
2.使用顯微鏡，用10×物鏡聚焦于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的網(wǎng)格線。
3.使用手動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)器，計(jì)數(shù)一組16個(gè)方格中未染色的活細(xì)胞（活細(xì)胞不吸收臺(tái)盼藍(lán)）（圖 1）。
計(jì)數(shù)時(shí)，采用固定規(guī)則進(jìn)行計(jì)數(shù)，如“記上不記下，計(jì)左不記右”。
按照同樣的指導(dǎo)原則，如果需要，也可以對(duì)用臺(tái)盼藍(lán)染色的死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以評(píng)估其活力。
圖 1. 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器圖表顯示了其中一個(gè)用于計(jì)數(shù)的16方格組（大方格，容積為1 mm3，0.1 μl）。
4 .將血細(xì)胞計(jì)數(shù)器移至下一組16個(gè)角方塊并繼續(xù)計(jì)數(shù)，直至所有4組16個(gè)角均計(jì)數(shù)完畢。
第4階段 細(xì)胞活力
1、計(jì)算活細(xì)胞數(shù)/mL
從每組16個(gè)角方塊中取出平均細(xì)胞數(shù)，乘以10,000（104），再乘以5，以校正添加臺(tái)盼藍(lán)后的1:5稀釋度，最終值為原始細(xì)胞懸液中活細(xì)胞數(shù)/mL。
例如，如果16個(gè)方格中的每個(gè)方格的單元格數(shù)量分別為 54、42、49、56，則平均單元格數(shù)量為：
(54 + 42 + 49 +56) ÷ 4 = 50.25
50.25 × 10,000 (104 ) = 502,500
原始細(xì)胞懸浮液中502,500 × 5 = 2,512,500個(gè)活細(xì)胞/毫升
2、計(jì)算細(xì)胞活力
如果記錄了每組16個(gè)角方塊的活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量，則可以計(jì)算出估計(jì)活力。
將活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)相加，得到總細(xì)胞數(shù)，再將活細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞活力。
?? 計(jì)算公式為：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）
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