蛋白質(zhì)去磷酸化實(shí)驗(yàn)方案
蛋白質(zhì)去磷酸化是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的生化過程，涉及從蛋白質(zhì)上的特定氨基酸殘基上去除磷酸基團(tuán)。該過程與蛋白質(zhì)磷酸化相對(duì)應(yīng)，兩者共同形成對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要的動(dòng)態(tài)平衡。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化作為一對(duì)可逆的生化反應(yīng)，通過“分子開關(guān)”的方式，精細(xì)調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及細(xì)胞內(nèi)的多種生理活動(dòng)。
蛋白質(zhì)去磷酸化的主要功能是由一類稱為蛋白質(zhì)磷酸酶的酶類催化完成的，這些酶能夠水解磷酸酯鍵，即絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸位點(diǎn)的去磷酸化。這一過程對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及與其他分子的相互作用至關(guān)重要。
蛋白質(zhì)去磷酸化的紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括糖尿病、肥胖、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病以及自身免疫性疾病等，因此蛋白質(zhì)磷酸酶也成為了潛在的藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)。在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)中，理解和調(diào)控蛋白質(zhì)去磷酸化過程對(duì)于揭示疾病機(jī)制和開發(fā)治療策略具有重要意義。
為了證明抗體對(duì)磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的特異性，可以在SDS-PAGE之前或轉(zhuǎn)移到膜之后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去磷酸化。與未處理的樣品相比，去磷酸化的樣品應(yīng)幾乎不染色或不染色。
所需材料
- 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）
- CIP緩沖液：100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM二硫蘇糖醇，25ºC時(shí)pH值調(diào)節(jié)至7.9
- 蛋白酶抑制劑混合物，不含EDTA
實(shí)驗(yàn)步驟
- SDS-PAGE之前對(duì)裂解物進(jìn)行去磷酸化
1.先用裂解緩沖液中裂解細(xì)胞或均質(zhì)化組織，然后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，留出兩份裂解物/均質(zhì)化組織樣本。一份用于去磷酸化，一條用于對(duì)照（未處理的樣品）。
注意：一般建議每條泳道的粗提取物含有20-30 µg的蛋白質(zhì)。
避免在裂解緩沖液中使用正釩酸鈉（RIPA 裂解緩沖液的一種成分）和 EDTA：10 mM正釩酸鈉可抑制CIP（10單位）90%的活性，而50 mM EDTA可使CIP活性（10單位）幾乎100%失活。
如果使用粗提取物，則必須在CIP緩沖液中加入蛋白酶抑制劑。
2.將蛋白質(zhì)/裂解物重懸于CIP緩沖液中，每1 µL 1× 緩沖液含1 µg蛋白質(zhì)，含蛋白酶抑制劑，不含EDTA。
3.向“+磷酸酶”處理的樣品中添加CIP酶，每µg蛋白質(zhì)添加1單位CIP。在37°C下最多孵育60分鐘，如果擔(dān)心蛋白水解降解，可以適當(dāng)縮短孵育時(shí)間，或者放到較低溫度下進(jìn)行孵育。
4.此時(shí)可以將樣品冷凍并保存，或按照SDS-PAGE的常規(guī)方式進(jìn)行后續(xù)操作。
注意：如果有需要的話，可以添加磷酸鈉（pH 7.4）作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，最終濃度為10 mM。
對(duì)于僅在蛋白質(zhì)變性時(shí)結(jié)合其磷酸化蛋白靶標(biāo)的抗體，轉(zhuǎn)膜后用磷酸酶處理膜可能比在SDS-PAGE前用磷酸酶處理未變性的裂解物更好。為了進(jìn)行良好的控制比較，用磷酸酶處理的膜應(yīng)該是從包含一個(gè)或多個(gè)重復(fù)泳道的單個(gè)凝膠印跡中切下的一塊。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF上，并用含有0.1% Triton X-100和5% BSA的TBS溶液在室溫下封閉膜1小時(shí)。
注意，這里不建議用牛奶替代BSA，牛奶中含有酪蛋白，一種磷酸化蛋白，如果抗體與磷酸化位點(diǎn)發(fā)生交叉反應(yīng)，則可能產(chǎn)生背景染色。
2.在轉(zhuǎn)膜完成后，使用標(biāo)記筆或刀片在膜上劃線，確保每個(gè)樣本和其重復(fù)樣本都被包含在不同的膜片段中。
3.然后沿著劃線切割膜，使得每個(gè)片段都至少包含一個(gè)樣本及其對(duì)應(yīng)的重復(fù)樣本。一個(gè)片段上可用于進(jìn)行去磷酸化處理，而另一個(gè)片段可用于常規(guī)檢測(cè)，從而比較處理前后的差異。
4 .將兩片分別放入裝有CIP緩沖液的容器中，每個(gè)容器3-5 mL。
5.往溶液中添加CIP，進(jìn)行去磷酸化處理。
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