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匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

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IPHASE/匯智和源 關(guān)于N-亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性的增強Ames試驗檢測
發(fā)布日期:2024/10/31 14:38:15發(fā)布人:匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

N-亞硝胺類雜質(zhì)是一類分子中含有N-亞硝基結(jié)構(gòu)的化合物,它們常以痕量濃度存在于食品、煙草、消毒后的飲用水及塑膠制品中,在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過程也會不可避免地會產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種N-亞硝胺類雜質(zhì)具有遺傳毒性風(fēng)險,可造成DNA損傷,進而誘發(fā)癌癥。因此,需要對含有N-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進行遺傳毒性檢測,評估其致突變性和致癌性風(fēng)險。

N-亞硝胺類雜質(zhì)

N-亞硝胺類化合物(N-nitrosamines,NAs)是一類含有亞硝基官能團,結(jié)構(gòu)通式為 R1(R2)N-N=O的化合物。其生成機制多樣,包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用,叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應(yīng),溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的氧化,橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用等。

N-亞硝胺類化合物在自然界和食品中廣泛存在,如室外空氣、水、土壤、熏肉、烤肉、酒精飲料、谷物、奶制品、魚類、水果和蔬菜,但含量較少。在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過程也會不可避免地會產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種NAs具有遺傳毒性風(fēng)險,即化合物存在DNA反應(yīng)活性,可造成無法修復(fù)的DNA損傷,甚至堿基突變,并可進而引發(fā)癌癥。遺傳毒性風(fēng)險通常與劑量無關(guān),存在遺傳毒性的化合物可以在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷,且該損傷效應(yīng)可通過遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大。

國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)目前已批準把十余種N-亞硝胺類化合物列入致癌物清單,其中N-亞硝基二甲胺(N-dimethylnitrosamine,NDMA)和N-亞硝基二乙胺(N-diethylnitrosamine,NDEA)被歸類為對人類致癌性證據(jù)有限,對實驗動物致癌性證據(jù)充分的2A類致癌物;還有數(shù)種N-亞硝胺類化合物被歸類為對人類致癌性證據(jù)不足,對實驗動物致癌性證據(jù)充分的2B類致癌物。此外,人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use,ICH)評估和控制藥物中DNA反應(yīng)性(致突變)雜質(zhì)的 ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險高的NAs列為“關(guān)注隊列”,并基于已知的致癌和致突變數(shù)據(jù),將其歸為“具有已知致癌致突變性”的Ⅰ類雜質(zhì),需要得到最為嚴格的控制。

N-亞硝胺類雜質(zhì)(N-nitrosamines)產(chǎn)生強烈致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)并非原型物質(zhì),而是其代謝產(chǎn)物。在諸多N-亞硝胺類化合物致癌機制中,當(dāng)前最廣為接受的是ɑ-羥基化假說,即N?亞硝胺ɑ-碳上的氫經(jīng)多種氧化酶和氧合酶(如細胞色素酶P450 CYP2E1和CYP2A6等)羥基化后可形成致癌物。N?亞硝胺首先被羥化酶激活生成α?羥基化亞硝胺,這是一種不穩(wěn)定且具有誘變性的中間體,可自發(fā)分解成甲醛和甲基重氮羥化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳,甲基重氮羥化物可以分解成烷基重氮離子,它可以與DNA堿基對反應(yīng),使DNA堿基烷基化生成烷基鳥嘌呤并誘發(fā)致癌反應(yīng)。以NDMA為例,其具體致癌機理如圖1所示。

圖1 NDMA的致癌機理(來源:藥品中N-亞硝胺類有害雜質(zhì))

并非所有N-亞硝胺類化合物均存在致突變性。隨著對藥品中亞硝胺類雜質(zhì)控制的重視,明確某個亞硝胺類化合物是否具有致突變性是界定其監(jiān)管限度的關(guān)鍵,因此,需要對含有N-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進行遺傳毒性檢測,評估其致突變性和致癌性風(fēng)險。

關(guān)于N-亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性檢測的增強Ames試驗

Ames試驗,又稱細菌回復(fù)突變試驗(Bacterial Reverse Mutation Test),于1975年建立并不斷發(fā)展完善,至今已成為國際上通用的遺傳毒理評價體系的必檢項目,同時也是許多遺傳毒理學(xué)新興技術(shù)發(fā)展過程中對照驗證結(jié)果的試驗之一,廣泛應(yīng)用于化合物的致突變性和潛在致癌性的初篩檢驗。

EMA最新發(fā)布的“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product(EMA Q&As指南)”中提到,對N-亞硝胺而言,由于某些N-亞硝胺(如NDMA)在標準Ames試驗的條件下靈敏度低,因此建議采用FDA國家毒理學(xué)研究中心提供的增強Ames試驗(Enhanced Ames Test)的測定條件。因為FDA認為,用于Ames測試的標準方法可能不足以表征N-亞硝胺的致突變潛力,在某些情況下會產(chǎn)生已知致突變亞硝胺的陰性結(jié)果。對此,F(xiàn)DA國家毒理學(xué)研究中心一直在測試不同的條件,以開發(fā)增強Ames測試(Enhanced Ames Test),旨在對N-亞硝胺雜質(zhì)潛在致突變性提供更可靠的評估。

以下為FDA提供的增強Ames試驗(Enhanced Ames Test)條件:

試驗菌株

包括鼠傷寒沙門氏菌TA98, TA100, TA1535, TA1537和埃希氏大腸桿菌WP2 uvrApKM101)試驗菌株

試驗方法和預(yù)保溫時間

應(yīng)采用預(yù)保溫和非平板摻入法,建議預(yù)保溫時間為30分鐘。

 

S9的種類和濃度

增強Ames試驗應(yīng)在包含30%大鼠肝S930%倉鼠肝S9Hamster Liver S9中進行。大鼠和倉鼠的去線粒體上清液(S9s)應(yīng)用經(jīng)細胞色素P450酶誘導(dǎo)物質(zhì)(如苯巴比妥和β-萘黃酮組合物)處理的嚙齒類肝制備。

 

陰性(溶劑/賦形劑)對照

根據(jù)OECD 471指南,所用溶劑應(yīng)與Ames試驗兼容??捎玫娜軇┌ǖ幌抻冢海?/span>1)水;(2)有機溶劑,如乙腈、甲醇和二甲基亞砜(DMSO)。

當(dāng)使用有機溶劑時,在預(yù)保溫混合物中應(yīng)盡可能采用較低的體積,并證明所用有機溶劑的量不干擾N-亞硝胺的代謝活化。

 

陽性對照

根據(jù)OECD 471指南,應(yīng)同時進行菌種特異性陽性對照。 S9存在的情況下,已知具有誘變作用的兩種N-亞硝胺也應(yīng)作為陽性對照??捎玫?/span>N-亞硝胺陽性對照包括:NDMA、1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪、NDSRI。

關(guān)于Ames測定的所有其他建議均應(yīng)遵循OECD 471指南

需要指出的是,如果在標準的Ames試驗中產(chǎn)生了陽性結(jié)果,則沒有必要使用增強的Ames試驗條件進行額外的試驗。 如果標準Ames試驗是陰性結(jié)果,則需要進行增強Ames試驗檢測。如果結(jié)果為陰性,還應(yīng)進行體內(nèi)致突變性試驗,因為專家成員一致認為,單一的體外突變試驗不足以評估N-亞硝胺化合物的致癌性。如果體內(nèi)致突變試驗結(jié)果也是陰性,則必須進行專家知識和全面評估。在得出N-亞硝胺類化合物的非致突變性結(jié)論之前,應(yīng)徹底評估其致突變性,因此一些N-亞硝胺類雜質(zhì)是非致突變但致癌的,這一點必須要引起足夠重視。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

正如前文中提到的,N-亞硝胺類雜質(zhì)(N-nitrosamines)產(chǎn)生致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)是其代謝產(chǎn)物,結(jié)合EMA 關(guān)于亞硝胺雜質(zhì)問答文件中提到的“增強Ames試驗需要使用大鼠肝S9和倉鼠肝S9(Hamster Liver S9)作為代謝活化系統(tǒng)”,IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者,憑借先進的設(shè)備,專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗,繼成功研發(fā)誘導(dǎo)SD大鼠肝S9后,又成功開發(fā)出國內(nèi)首家誘導(dǎo)倉鼠(金黃地鼠)肝S9(Hamster Liver S9)。IPHASE誘導(dǎo)倉鼠(金黃地鼠)肝S9是使用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)倉鼠(金黃地鼠)的肝臟制備而成,經(jīng)過了無菌檢查、代謝活性檢測,并以Ames和染色體畸變試驗進行質(zhì)控,結(jié)果顯示誘導(dǎo)倉鼠(金黃地鼠)肝S9與誘導(dǎo)SD大鼠肝S9試驗結(jié)果接近,說明倉鼠(金黃地鼠)肝S9符合標準,可滿足體外遺傳毒理試驗需求。

此外,IPHASE現(xiàn)已開發(fā)出了遺傳毒性Ames試劑盒、體外染色體畸變試劑盒等一系列專門用于體外遺傳毒性研究的產(chǎn)品,助力廣大客戶進行體外遺傳毒理學(xué)研究。

名稱

規(guī)格

誘導(dǎo)倉鼠(金黃地鼠)肝S9

35mg/mL1mL

誘導(dǎo)混合SD大鼠肝S9

35mg/mL,1mL

體外微核試驗試劑盒

5mL*32 test

遺傳毒性Ames試劑盒

100/150/200/250 dishes

遺傳毒性Mini-Ames試劑盒

6孔板*24/6孔板*40

微量波動Ames試劑盒

16*96 wells/ 4*384 wells

UMU遺傳毒性試劑盒

96 wells

TK基因突變試劑盒

20ml*36 test

HGPRT基因突變試劑盒

20ml*36 test

體外染色體畸變試劑盒

5mL*30 test

彗星試驗試劑盒

20/50 test

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗,推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑,為藥物早期研發(fā)提供篩選工具,為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段,為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品,望廣大科研工作者來電咨詢,咨詢熱線400-127-6686。

參考資料:

[1] Questions and Answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products.EMA,2024.

[2] 曹夢茹,葉志偉,汪雋,等. 藥品中N-亞硝胺類有害雜質(zhì)[J]. 化學(xué)進展,2023, 35(12): 1881-1894.

[3] 葉倩,耿興超,張河戰(zhàn),等. 亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略及思考[J]. 中國藥事,2021, 35(2): 127-137.

[4] 葉倩,汪褀,文海若. 不同代謝活化條件對 N-亞硝胺類化合物細菌回復(fù)突變結(jié)果的影響[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù),2022, 17(2): 118-124.

[5] 于穎潔. 藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)的檢測方法研究[D]. 中國食品藥品檢定研究院. 2021.

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