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匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

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IPHASE/匯智和源 轉(zhuǎn)運(yùn)體研究試驗(yàn)原理、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及常見(jiàn)問(wèn)題解答
發(fā)布日期:2024/12/10 13:22:38發(fā)布人:匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

第一題 如何評(píng)估吸附能力強(qiáng)的化合物分子是吸附在細(xì)胞表面或是轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)部?清洗次數(shù)如何確定?
答:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞通過(guò)和MOCK細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比,吸附能力強(qiáng)的化合物分子會(huì)在轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞和MOCK細(xì)胞上同時(shí)吸附,而轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞可將化合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞,MOCK細(xì)胞不能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),通過(guò)檢測(cè)結(jié)果即可判斷。清洗次數(shù)可以對(duì)每次清洗的上清液進(jìn)行檢測(cè),當(dāng)清洗相應(yīng)次數(shù)后上清液檢測(cè)不到待測(cè)化合物時(shí),即可確定清洗次數(shù)。

第二題 PROTAC,小核酸吸附強(qiáng)是否可以用膜囊泡?
答:對(duì)于PROTAC分子或小核酸這類吸附性強(qiáng)的化合物,使用膜囊泡模型是合適的,因?yàn)槟つ遗菘梢允笰BC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合位點(diǎn)暴露于細(xì)胞外緩沖液中,更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。

第三題 瞬轉(zhuǎn)SLC細(xì)胞在液氮凍存,時(shí)間久了是否會(huì)影響蛋白活性?
答:SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng),蛋白活性會(huì)逐步降低。

第四題 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞在藥物作用前去掉培養(yǎng)液后,是否需要用反應(yīng)緩沖液預(yù)孵育幾分鐘?
答:通常情況下,去掉培養(yǎng)液后,細(xì)胞可能會(huì)需要一段時(shí)間來(lái)適應(yīng)新的環(huán)境,使用反應(yīng)緩沖液預(yù)孵育可以幫助細(xì)胞穩(wěn)定,減少由于環(huán)境變化引起的影響。

第五題 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最后一步裂解囊泡除了乙腈是否可以使用其他的有機(jī)試劑?如果離心離不下來(lái)是否和裂解試劑不合適有關(guān)?
答:強(qiáng)堿類(NaOH),甲醇等均可以,離心推薦轉(zhuǎn)速8000rpm-16000rpm,離心力過(guò)低不易離心下去。

第六題 不同表達(dá)宿主,Sf9和HEK293,表達(dá)出來(lái)的Vesicle細(xì)胞是否會(huì)有差異?
答:Sf9和HEK293作為不同的宿主在蛋白質(zhì)修飾、折疊和分泌機(jī)制不同,相較于SF9而言,HEK293(人胚胎腎)細(xì)胞表達(dá)的Vesicle細(xì)胞其蛋白質(zhì)修飾和分泌機(jī)制更接近人體自然狀態(tài)下的生物過(guò)程。

第七題 早期化合物多篩選階段主要推薦做哪幾個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)?
答:主要推薦的轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)包括底物抑制實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性實(shí)驗(yàn),包括指南推薦的7種SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體。

第八題 做囊泡實(shí)驗(yàn)使用的反應(yīng)管是每個(gè)單獨(dú)的嗎?
答:是的,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)會(huì)使用單獨(dú)的反應(yīng)管來(lái)進(jìn)行囊泡實(shí)驗(yàn),這樣可以為每個(gè)樣本提供更靈活的操作和處理?xiàng)l件。

第九題 選擇微孔板過(guò)濾器時(shí),PVDF材質(zhì)和Glass Fiber這兩種材質(zhì)有何區(qū)別?
答:PVDF材質(zhì)和Glass Fiber各有特點(diǎn),PVDF具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和耐熱性,而Glass Fiber則提供了較高的孔隙率和流速。針對(duì)囊泡裂解使用的是乙腈,PVDF材質(zhì)效果更好。

第十題 若低中濃度做出來(lái)不是轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物,高濃度做出來(lái)是,具體是什么原因?
答:首先需要確定低中濃度的范圍是否儀器可以檢測(cè)到,例如選取的底物濃度在儀器的檢測(cè)基線以下,則無(wú)法反應(yīng)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

十一題 對(duì)于OATP1B1和1B3,采用共孵育也可以達(dá)到要求,是否還需要預(yù)孵育?
答:參照指導(dǎo)原則推薦,OATP1B1和1B3存在時(shí)間依賴性抑制,需要進(jìn)行預(yù)孵育。

十二題 囊泡的結(jié)果如何評(píng)判?
答:根據(jù)指導(dǎo)原則的要求,待測(cè)底物轉(zhuǎn)運(yùn)活性大于2倍,且通過(guò)已知抑制劑抑制率大于50%,即可判定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物。待測(cè)抑制劑,需通過(guò)已知底物檢測(cè),抑制率大于50%即可判定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑。

十三題 反應(yīng)條件是水浴鍋還是搖床?
答:37℃水浴鍋或者搖床都可以,但搖床需要靜止。

十四題 囊泡、細(xì)胞、PAMPA三種實(shí)驗(yàn)是否有必要都做?若只做一種,優(yōu)先級(jí)是否為表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?
答:囊泡、細(xì)胞和PAMPA三種實(shí)驗(yàn)各有優(yōu)勢(shì)和局限性。囊泡實(shí)驗(yàn)可以提供關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的直接信息,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以模擬體內(nèi)環(huán)境,而PAMPA則是一種快速篩選工具。如果只做一種實(shí)驗(yàn),過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻模囊泡更接近人體自然狀態(tài)下的生物過(guò)程,同時(shí)便于檢測(cè),因此優(yōu)先級(jí)較高。

十五題 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞藥物作用終止后,用乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑或反復(fù)凍融方法是否都可以裂解細(xì)胞?
答:是的,乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑以及反復(fù)凍融方法都可以用來(lái)裂解細(xì)胞。

十六題 高通透性化合物為什么不需要預(yù)孵育?透膜的能力是否和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合能力一致?
答:高通透性化合物不需要預(yù)孵育是因?yàn)樗鼈兛梢匝杆偻ㄟ^(guò)細(xì)胞膜,不需要額外的時(shí)間來(lái)與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。透膜能力和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合能力并不總是一致的,因?yàn)樗鼈兪芏喾N因素的影響,包括分子大小、電荷、脂溶性等。

十七題 囊泡是否能搖?
答:底物與囊泡孵育過(guò)程需要靜置,都處于游離狀態(tài)時(shí),底物與囊泡不易結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

十八題 不能用水浴鍋是否因?yàn)榕涮椎墓茏硬皇欠忾]的?
答:配套的微孔過(guò)濾器適用于囊泡的后半部分進(jìn)行清洗過(guò)程,前期孵育需自備普通1.5ml離心管,或者PCR小管。

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