背景及概述^[1]

衛(wèi)星細(xì)胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。分布于周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)有兩種，一稱(chēng)Schwann細(xì)胞，亦名神經(jīng)膜細(xì)胞，另一種即為衛(wèi)星細(xì)胞。后者位于神經(jīng)細(xì)胞胞體的周?chē)?，為扁平或立方形，可能有保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元的作用。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌中位于細(xì)胞膜和肌膜之間的具有增殖分化潛力的肌源性干細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨骼肌的生長(zhǎng)和損傷修復(fù)。近年來(lái)，國(guó)外有報(bào)道將肌衛(wèi)星細(xì)胞移植到凍傷的骨骼肌中，可改善肌肉功能。另外，骨骼肌可能會(huì)通過(guò)分泌低分子量細(xì)胞因子即骨骼肌源性抑瘤物顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。有研究探討體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離純化、原代與傳代的培養(yǎng)方法，在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中改變培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)與分化的影響；以及隨時(shí)間的推移，骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化特征，為將來(lái)進(jìn)行骨骼肌干細(xì)胞臨床應(yīng)用，治療心肌梗死及防治腫瘤奠定基礎(chǔ)。

獲取與培養(yǎng)^[2]

1.取材。將新生大鼠拉頸椎處死，再用碘酒和乙醇消毒腿部，將新生鼠放入超凈工作臺(tái)后，取腿部肌肉置于平皿中。用Hank's液洗滌3次，并剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物。用手術(shù)剪將肌肉剪成小塊(1mm3)，轉(zhuǎn)移至離心管中，再用Hank's液洗3次，靜置1min后棄去上層液體及漂浮組織。

2.組織塊培養(yǎng)法。將剪碎的肌肉碎片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶(經(jīng)L-多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)瓶與未包被的各半，以形成對(duì)照組)內(nèi)，貼附于瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置3～5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)瓶中(勿使組織塊漂浮)，繼續(xù)培養(yǎng)。3d后換液，以后每天換液1次。

3.細(xì)胞培養(yǎng)法。向上述離心管中加入0.25%的胰蛋白酶，置于37℃水浴鍋中消化20min，每隔5min搖動(dòng)1次離心管，或用吸管吹打1次，使細(xì)胞分離。然后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打后，依次濾過(guò)100、200、400目的篩網(wǎng)，濾液收集后，1000r/min離心10min，棄上清，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入未經(jīng)L-多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，37℃培養(yǎng)1h后移至經(jīng)L-多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，4d后換液，以后每天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞達(dá)到一定密度后，將培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去，用0.25%胰酶溶液消化10～30s，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其完全脫落，以1∶1的比例傳代，每天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

5.分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化取培養(yǎng)至第2代的細(xì)胞，消化后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞分裂、增殖至80%匯合后，改用分化培養(yǎng)基(含2%小牛血清的培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及分化情況[10-11]。

6.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定將細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)小牛血清濃度降至2%，3～4d后細(xì)胞相互融合成肌管，肌管為光滑長(zhǎng)條形。雖然衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)與成纖維細(xì)胞極為相似，但在鏡下仍顯示出有較大的差別。成纖維細(xì)胞的形態(tài)呈扁平、多突起的，而衛(wèi)星細(xì)胞早期則以梭形、紡錘形為主，相互之間以細(xì)絲拉網(wǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖、相互融合并逐漸規(guī)律性地沿一個(gè)方向平行排列，并形成多核的肌管。傳代后2h就開(kāi)始貼壁。倒置顯微鏡下觀察到分離純化的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為圓形，折光性強(qiáng)，24h后開(kāi)始貼壁，96h后完全貼壁，細(xì)胞呈梭形或紡錘形，中間夾雜少量未過(guò)濾掉的纖維碎片，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。隨細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞逐漸有規(guī)律地平行排列(圖1-B)。當(dāng)細(xì)胞融合到一定程度之后，不需要加分化培養(yǎng)基也可自發(fā)性地相互融合，形成肌管(圖1-E)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)室溫下20s消化結(jié)果，1∶1接種于培養(yǎng)瓶中，傳代細(xì)胞30min后開(kāi)始貼壁，24h內(nèi)貼壁完全，增殖速度也比原代快。傳至第2代的細(xì)胞培養(yǎng)2d，待其完全貼壁后，采用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。

主要參考資料

[1] 協(xié)和醫(yī)學(xué)詞典

[2] 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的研究