背景^[1-6]

MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒是針對(duì)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒cDNA二鏈合成模塊配有兩種buffer，可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫(kù)或鏈特異性建庫(kù)。本產(chǎn)品適用于起始模板為10 ng-1μg不同來(lái)源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過(guò)mRNA分離、片段化、鏈雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫(kù)擴(kuò)增，總RNA樣品zui終轉(zhuǎn)化為適用于Illumina平臺(tái)測(cè)序的文庫(kù)。

試劑盒包含三個(gè)獨(dú)立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。

提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，zui大程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒適用于起始模板量為10-1000 ng（體積≤50μL）的高質(zhì)量動(dòng)物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過(guò)50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠進(jìn)行濃縮。RNA需通過(guò)Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測(cè)，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。

MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo d(T)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提?。黄渌痪遬oly(A)尾的mRNA，如非編碼RNA、無(wú)poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴(yán)重，通常無(wú)完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，故亦無(wú)法使用本試劑盒進(jìn)行建庫(kù)。

文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1.通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2.文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit、PicoGreen等；基于qPCR定量的方法。

3.推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4.文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop等。

5.文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

應(yīng)用^[7][8]

MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒所制備文庫(kù)可進(jìn)行多種RNA-Seq應(yīng)用，包括：

基因表達(dá)（gene expression）

單核苷酸變異檢測(cè)（single nucleotide variation discovery）

基因融合鑒定（gene fusion identification）

剪切變異體分析（splice variant analysis）

通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing,NGS),對(duì)垂體ACTH腺瘤全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序,在轉(zhuǎn)錄組水平篩選相關(guān)差異表達(dá)基因和microRNA;并與患者臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,探究垂體ACTH腺瘤所致臨床表型的分子機(jī)理,此外,考慮到血清游離miRNA具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力,篩選差異表達(dá)的血清miRNA,并對(duì)差異表達(dá)的血清miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證,為深入研究庫(kù)欣病的發(fā)病機(jī)制,篩選診斷標(biāo)志物提供依據(jù)。

以期最終實(shí)現(xiàn)垂體腺瘤患者個(gè)性化治療。垂體腺瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)良性腫瘤之一,發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤第二位,約占顱內(nèi)腫瘤的10%-15%,并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。隨著腫瘤不斷生長(zhǎng),可壓迫蝶鞍區(qū)周圍結(jié)構(gòu),如視神經(jīng)、海綿竇、腦底動(dòng)脈、下丘腦等,甚至累及額葉、腦干,而導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙。同時(shí),腫瘤生長(zhǎng)還可導(dǎo)致垂體激素分泌紊亂。

按照外周血激素水平,垂體腺瘤分為無(wú)功能型垂體腺瘤(NFPA)和功能型垂體腺瘤,包括：泌乳素腺瘤(PRL)、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(Cushing)、生長(zhǎng)激素腺瘤(GH)、促甲狀腺激素腺瘤(TSH)、促性腺激素腺瘤(PGA)以及混合激素分泌腺瘤等。其中垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(ACTH-PAs)臨床又稱為庫(kù)欣病(Cushing’s Disease)是一種伴有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌的功能型垂體腺瘤約占全部垂體腺瘤的14%,約占庫(kù)欣綜合征(Cushing’s syndrome)的70%。

參考文獻(xiàn)

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