背景[1-4]
MAXUPMRNA建庫(kù)試劑盒是針對(duì)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒cDNA二鏈合成模塊配有兩種buffer，可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫(kù)或鏈特異性建庫(kù)。適用于起始模板為10 ng-1μg不同來(lái)源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、鏈雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫(kù)擴(kuò)增，總RNA樣品zui終轉(zhuǎn)化為適用于Illumina平臺(tái)測(cè)序的文庫(kù)。
試劑盒包含三個(gè)獨(dú)立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。
MaxUp mRNA建庫(kù)試劑盒適用于起始模板量為10-1000 ng（體積≤50μL）的高質(zhì)量動(dòng)物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠進(jìn)行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測(cè)，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。MAXUPMRNA建庫(kù)試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo d(T)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的mRNA，如非編碼RNA、無(wú)poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴(yán)重，通常無(wú)完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，故亦無(wú)法使用本試劑盒進(jìn)行建庫(kù)。
MAXUPMRNA建庫(kù)試劑盒所制備文庫(kù)可進(jìn)行多種RNA-Seq應(yīng)用，包括：
基因表達(dá)（gene expression）
單核苷酸變異檢測(cè)（single nucleotide variation discovery）
基因融合鑒定（gene fusion identification）
剪切變異體分析（splice variant analysis）
應(yīng)用[5][6]
用于基于高通量Illumina測(cè)序技術(shù)的干旱脅迫下大豆根和葉mRNA表達(dá)譜研究農(nóng)作物必須適應(yīng)各種極端脅迫環(huán)境。大豆是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,其產(chǎn)量明顯的受干旱脅迫影響,因此培育與耐旱相關(guān)的作物已成為當(dāng)務(wù)之急。雖然目前在研究耐旱機(jī)理方面取得了一定的進(jìn)展,但是耐旱的分子機(jī)制仍然不十分清楚。為了更好的理解大豆響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制,同時(shí)克隆大豆中與干旱密切相關(guān)的干旱應(yīng)答基因,研究旱堿1號(hào)大豆幼苗在干旱脅迫(含有2% PEG 8000的Hoagland培養(yǎng)液)下48小時(shí)根和葉的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜?；谇捌诘囊恍?shí)驗(yàn),我們通過高通量Illumina測(cè)序研究基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果如下：
1.干旱脅迫下根和葉中分別有2956個(gè)和1620個(gè)差異表達(dá)基因。其中,根特異性差異基因2383個(gè),葉特異性差異基因1047個(gè),根葉共表達(dá)差異基因573個(gè)。
2.BGI WEGO軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了主要生物學(xué)功能分類。干旱脅迫下所有差異表達(dá)基因中,描述基因細(xì)胞組件的有11類,描述基因分子功能的有12類,描述基因參與的生物過程的有16類。
3.通過cluster和javaTreeview軟件,對(duì)根葉共表達(dá)差異基因進(jìn)行了聚類分析,在逆境條件下表達(dá)相似的基因成簇的聚到一起。
4.通過對(duì)干旱脅迫應(yīng)答基因的研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下與核苷酸途徑相關(guān)的一些順式作用元件和反式作用因子基因表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步對(duì)這些基因在分子水平上進(jìn)行分析,表明這些基因處在ABA依賴和ABA非依賴兩大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,同時(shí)這些pathway彼此之間相互聯(lián)系。
5.應(yīng)用Real-time RT-PCR方法驗(yàn)證分析了Illumina測(cè)序出的6個(gè)基因,結(jié)果表明這6個(gè)基因在干旱脅迫下表達(dá)量改變倍數(shù)和表達(dá)譜測(cè)序中獲得的差異表達(dá)倍數(shù)基本一致,從而表明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
參考文獻(xiàn)
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[2]Sequence analysis of mRNA polyadenylation signals of rice genes[J].Ying Lu,Chenxi Gao,Bin Han.Chinese Science Bulletin.2006(9)
[3]Cloning and sequence analysis of a low temperature-induced gene from trifoliate orange with unusual pre-mRNA processing[J].Y.Jia,H.S.Rio,A.L.Robbins,E.S.Louzada.Plant Cell Reports.2004(3)
[4]Characterization of the genes for two soybean aspartic proteinases and analysis of their different tissue-dependent expression[J].Kaede Terauchi,Tomiko Asakura,Naoko K.Nishizawa,Ichiro Matsumoto,Keiko Abe.Planta.2004(6)
[5]MECHANISMS OF ALTERNATIVE PRE-MESSENGER RNA SPLICING[J].Douglas L.Black.Annual Review of Biochemistry.2003
[6]范秀朵. 基于高通量Illumina測(cè)序技術(shù)的干旱脅迫下大豆根和葉mRNA表達(dá)譜研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.