背景[1-6]
人DNA損傷信號通路PCR芯片通路PCR芯片可用于研究參與DNA損傷信號通路的84個(gè)基因的表達(dá)。
相關(guān)的基因是那些與ATR/ATM信號網(wǎng)絡(luò)和DNA損傷反應(yīng)的可轉(zhuǎn)錄靶目標(biāo)有關(guān)的基因。DNA損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡，影響基因組穩(wěn)定和修復(fù)。使通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法，研究者即能夠利用該芯片簡單可靠地同時(shí)檢測與DNA損傷信號通路相關(guān)的基因表達(dá)。DNA損傷響應(yīng)涉及到損傷的感應(yīng)、信號的傳遞、DNA修復(fù)等一系列通路和過程。
在這些過程中,有大量蛋白質(zhì)以其不同的修飾狀態(tài)參與其中。有些蛋白質(zhì)的修飾參與信號的識別和傳遞;有些修飾改變酶的活性;而有些修飾則參與調(diào)節(jié),有大量的研究者對參與DNA損傷相關(guān)蛋白的功能及修飾進(jìn)行了研究。它們在DNA損傷響應(yīng)分別發(fā)揮著不同的功能,其協(xié)同作用使細(xì)胞得以從細(xì)胞周期關(guān)卡中恢復(fù),進(jìn)入正常周期。有大量研究者對參與DNA損傷相關(guān)蛋白的功能及其修飾進(jìn)行了研究。
DNA損傷信號通路ChIP qPCR芯片分析參與DNA損傷信號通路的48個(gè)關(guān)鍵基因的組蛋白修飾狀態(tài)或組蛋白密碼。組蛋白修飾調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。每天暴露在環(huán)境因素(如活性氧物種,使甲基化劑、紫外線,和其他電離輻射),甚至正常的生理過程(如復(fù)制和重組)都會損DNA。DNA損傷是公認(rèn)的細(xì)胞周期檢查點(diǎn),這樣細(xì)胞可以逮捕細(xì)周期進(jìn)程并修復(fù)有絲分裂前損傷,或進(jìn)行細(xì)胞凋亡如果損害無法挽回。細(xì)胞必須修復(fù)DNA損傷,防止突變的積累和維持基因組的完整性和穩(wěn)定性。
癌癥進(jìn)程中可能出現(xiàn)突變或組蛋白修飾導(dǎo)致這個(gè)信號通路失調(diào)。理解DNA損傷信號通路基因的組蛋白編碼的變化可能會幫助闡明腫瘤形成的分子與表觀遺傳機(jī)制。這個(gè)芯片包含對細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用的基因,以及參與DNA修復(fù)的基因。利用這個(gè)芯片通過染色質(zhì)免疫沉淀和實(shí)時(shí)定量PCR，可以很簡易、可靠地分析組蛋白的化學(xué)修飾模式與DNA損傷信號通路相關(guān)重要基因集的關(guān)聯(lián)。
應(yīng)用[7][8]
人DNA損傷信號通路PCR芯片可用于人DNA損傷信號通路的相關(guān)研究：
葉酸在MNNG致哈族DNMT1高表達(dá)細(xì)胞DNA損傷及相關(guān)信號通路中作用的研究中DNMT1高表達(dá)在DNA甲基化模式的轉(zhuǎn)變和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用。在前期已建立的哈薩克族食管上皮永生化細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,利用TALE技術(shù)構(gòu)建DNMT1高表達(dá)的哈薩克族食管上皮細(xì)胞株,分析葉酸在MNNG致哈族食管上皮細(xì)胞DNMT1高表達(dá)細(xì)胞DNA損傷及相關(guān)信號通路調(diào)控機(jī)制中的作用,探討葉酸對MNNG致細(xì)胞損傷過程中的干預(yù)作用,為食管癌預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
方法:將哈族食管上皮細(xì)胞及哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞分別分為三組,使用MNNG進(jìn)行染毒并分別施以低濃度葉酸、中等濃度葉酸及高濃度葉酸干預(yù),使用倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞生長情況;應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(彗星實(shí)驗(yàn))檢測各組細(xì)胞DNA損傷情況;應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN、AKT基因mRNA表達(dá)水平;應(yīng)用Western blot法檢測各組細(xì)胞PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN、AKT的蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:(1)兩種哈族食管上皮細(xì)胞形態(tài)損傷情況隨染毒時(shí)間延長而加重,且在相同干預(yù)情況下,DNMT1高表達(dá)細(xì)胞較非高表達(dá)細(xì)胞受MNNG影響更為嚴(yán)重,但高濃度葉酸組細(xì)胞較同類型同時(shí)期低、中濃度葉酸組生長情況良好,細(xì)胞死亡率低,細(xì)胞排列整齊,形態(tài)正常,細(xì)胞鏡下形態(tài)最接近于同類同時(shí)期對照組細(xì)胞;(2)兩種食管上皮細(xì)胞DNA損傷情況隨染毒時(shí)間延長而加重,且哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞較哈族食管上皮細(xì)胞DNA損傷情況更為嚴(yán)重,表現(xiàn)為尾長在染毒早期、中期、晚期時(shí)高于正常細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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