背景^[1-6]

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)提取細(xì)菌（革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌）的基因組DNA。溶菌酶能有效去除細(xì)菌細(xì)胞壁；蛋白酶K能把核酸解離出來(lái)；RNaseA能去除痕量的RNA污染；離心吸附柱能夠高效、專(zhuān)一吸附DNA，限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒用于細(xì)菌基因組DNA的小量提取。其純化原理是利用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞釋放基因組DNA，由硅膠膜柱可逆吸附基因組DNA，經(jīng)蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)后，用純化液洗脫獲得基因組DNA。本產(chǎn)品可從0.5-2 ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液（不超過(guò)106–108個(gè)）中提取到3-20μg超純基因組DNA（OD260/280=1.7-1.9），此基因組DNA可直接用于酶切、PCR等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1.取細(xì)菌培養(yǎng)液1–2 ml，10,000 g離心1分鐘，盡量吸凈上清；向細(xì)菌沉淀中加入180μl EB，旋渦混勻后加入18μl溶菌酶，室溫放置10-15分鐘，期間間歇混勻幾次。

2.10,000g離心1分鐘，吸棄大部分上清，留下約10μl液體，徹底混勻。

3.向菌體沉淀中加入200μl緩沖液GA，混勻。

4.向管中加入20μl蛋白酶K，混勻，55℃處理15-30分鐘，期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。

5.加入10μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

6.加入220μl緩沖液GB，混勻，70℃放置10-30分鐘（對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)到60分鐘）。

7.加入220μl無(wú)水乙醇，充分混勻。

8.將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g離心5分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

9.向吸附柱CG中加入500μl去蛋白液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000 g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

10.向吸附柱CG中加入700μl漂洗液GW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000 g離心60秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

11.向吸附柱CG中加入500μl漂洗液GW，11,000 g離心60秒，倒掉廢液。

12.吸附柱CG放回收集管中，11,000 g離心2分鐘。

13.將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11,000 g離心2分鐘。

14.DNA產(chǎn)物-20℃保存。

應(yīng)用^[7][8]

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒可用于細(xì)菌基因組DNA提?。?/p>

對(duì)蝦腸道中存在大量的微生物群落,它們對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)、生理、免疫和疾病防御起著重要的作用。近來(lái)微生態(tài)制劑開(kāi)始用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中以促進(jìn)其生長(zhǎng)、提高免疫力和減少病害發(fā)生。水產(chǎn)微生態(tài)制劑作為抗生素的替代品,代表水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治當(dāng)前和未來(lái)的發(fā)展方向,但是其被水產(chǎn)動(dòng)物口服后的作用機(jī)理并不是十分清楚。了解對(duì)蝦腸道微生物區(qū)系中微生物的組成、結(jié)構(gòu)及其生理功能如何,在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步研究外源有益微生物制劑對(duì)其影響,將有助于微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的有效應(yīng)用與推廣。

應(yīng)用PCR-DGGE法和16S rDNA文庫(kù)法研究分析中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦腸道微生物組成,鑒定其優(yōu)勢(shì)種群；比較分析芽孢桿菌和檸檬酸等對(duì)日本囊對(duì)蝦腸道微生物的影響；比較分析水產(chǎn)常用抗生素氟苯尼考對(duì)日本囊對(duì)蝦腸道微生物的影響,為養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道微生物區(qū)系的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

主要研究結(jié)果如下：1.健康成年中國(guó)明對(duì)蝦腸道微生物樣品經(jīng)DGGE分離得到22個(gè)不同位置的條帶,鑒定后分別屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)兩大類(lèi)群,分別為冷桿菌屬,不動(dòng)桿菌屬,假單胞菌屬,希萬(wàn)氏菌屬,海洋螺菌屬,弧菌屬,Thalassobius屬,腸球菌屬：構(gòu)建16S rRNA克隆文庫(kù),克隆子經(jīng)測(cè)序比對(duì)后分別屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)兩大類(lèi)群,分別為腸桿菌屬,弧菌屬,希萬(wàn)氏菌屬,亮發(fā)菌屬,紅細(xì)菌屬,弓形桿菌屬,Loktanella屬,玫瑰桿菌屬,黃桿菌屬,不可培養(yǎng)細(xì)菌。

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