背景^[1-3]

NOX4抗體是一種可以特異性結(jié)合NOX4的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的NOX4蛋白。NOX4抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

Nox4抗體（C-3）是一種小鼠單克隆IgG2b kappa輕鏈抗體，專門用于檢測人類Nox4蛋白，也稱為Renox，是NADPH氧化酶家族的重要組成部分。Nox4通過產(chǎn)生活性氧（尤其是超氧陰離子）在細胞氧化還原信號傳導中發(fā)揮重要作用，而活性氧對于調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和缺氧反應等過程至關(guān)重要。翻譯后修飾（如磷酸化）可調(diào)節(jié)Nox4的活性，并促進其與p47-phox和p67-phox等蛋白的相互作用，這些蛋白對于組裝活性NADPH氧化酶復合物是必不可少的。此外，Nox4還與TGF-β等通路中的關(guān)鍵信號蛋白相互作用，從而凸顯其在纖維化和血管重塑等過程中的作用。

將抗Nox4抗體（C-3）用于蛋白質(zhì)印跡（WB）、免疫沉淀（IP）、免疫熒光（IF）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），這些應用中均能證明其與人類Nox4的反應性。Nox4在腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞中大量表達，Nox4有助于促紅細胞生成素的產(chǎn)生，此外在胎兒組織、胎盤、膠質(zhì)母細胞瘤細胞和血管細胞中也有發(fā)現(xiàn)。在血管細胞中，Nox4表達會因血管緊張素II而上調(diào)，這強調(diào)了Nox4在血管氧化應激反應中的重要性及其對心血管疾病的潛在影響。Nox4(C-3)抗體適用于研究Nox4在各種生物學環(huán)境中的不同功能和調(diào)節(jié)機制的研究人員。

NOX4抗體

NOX4抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（NOX4抗體按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(NOX4抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

NOX4抗體可以用于剪接調(diào)控蛋白ESRP1和NOX4對氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用的研究

探討ESRP和NOX4對慢性阻塞性肺疾病上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的影響,以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)上皮剪切過程。

研究方法:1、建立COPD煙熏小鼠模型,探索ESRP1、NOX4與小鼠氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的關(guān)系:在廣州醫(yī)科大學EC的審核下,我們從C57BL/6J周齡的((8-10周齡、18-20g/只)共48只,隨機分為對照組(空氣暴漏組)和CS組(煙霧暴漏組),造模時間12周及24周后麻醉狀態(tài)下處死;分別于造模12周及24周后均行肺功能檢測評估COPD造模效果,留取外周血及肺泡灌洗液通過ELISA實驗、吉姆薩染色等檢測氧化應激指標及炎性指標,留取肺組織通過免疫組織化學染色、蛋白免疫印跡等檢測ESRP1、NOX4及ECM標志物。2、體外BEAS-2B細胞研究ESRP1、NOX4在上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用及可能的信號機制:培養(yǎng)氣道上皮細胞系(BEAS-2B),分別用CSE、TGFβ1干預細胞后,使用NOX4抗體免疫印跡、免疫細胞化學、免疫熒光定量檢測ESRP1、NOX4及ECM標志物,流式細胞術(shù)來檢測細胞內(nèi)ROS的水平。通過ELISA技術(shù),我們可以測量培養(yǎng)基上清中MDA和SOD3的表達水平,并使用NOX4抑制劑GKT138731對BEAS-2B細胞進行預處理,然后再使用TGFβ1繼續(xù)作用,以NOX4抗體蛋白免疫印跡技術(shù)來檢測ESRP1和ECM標志物的表達,以確保細胞的健康。此外,我們還可以使用NAC技術(shù),在細胞之間進行預處理,然后再使用TGFβ1繼續(xù)作用,以確保細胞的健康。通過蛋白免疫印跡技術(shù),我們可以確定NOX4、ESRP1和ECM標志物的表達水平是否一致。

參考文獻

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[5]王佳琪.剪接調(diào)控蛋白ESRP1和NOX4對氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用的研究[D].寧夏醫(yī)科大學,2023.