背景^[1-3]

VAPB抗體是一種可以特異性結(jié)合VAPB的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的VAPB蛋白。VAPB抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

VAPB基因編碼的蛋白質(zhì)是在血漿和細(xì)胞內(nèi)囊泡膜中發(fā)現(xiàn)的IV型膜蛋白。發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白質(zhì)是同源二聚體和與VAPA的異源二聚體。這種蛋白質(zhì)還可以與VAMP1和VAMP2相互作用，并可能參與囊泡運(yùn)輸。

VAPB抗體

VAPB抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（VAPB抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(VAPB抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

VAPB抗體可以用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源囊泡中microRNA-335通過Vapb和Wnt/β-catenin通路促進(jìn)骨折恢復(fù)作用機(jī)制研究

microRNA-335通過Vapb和Wnt/β-catenin通路促進(jìn)骨折恢復(fù):1.MTT方法檢測(cè)了成骨細(xì)胞MC3T3和MG63細(xì)胞的增殖率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVs的處理促進(jìn)了細(xì)胞增殖。TUNEL染色結(jié)果顯示,EV處理可抑制細(xì)胞凋亡;2.F-actin的免疫熒光染色觀察了MC3T3和MG63細(xì)胞的細(xì)胞粘附,發(fā)現(xiàn)B-EV處理對(duì)細(xì)胞粘附無明顯影響;3.人I型膠原蛋白(Human type I collagen,ColⅠ)的免疫熒光染色證明B-EVs促進(jìn)ColⅠ表達(dá),與茜素紅染色結(jié)果一致。RT-q PCR和western blot分析驗(yàn)證B-EV處理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平;4.RT-q PCR顯示EVs-Inhibitor處理后miR-335表達(dá)明顯下降,并伴有細(xì)胞增殖率的下降和細(xì)胞凋亡的增加。而且,ALP、茜素紅和ColⅠ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),B-EVs攜帶的miR-335的干預(yù)部分抵消了B-EVs對(duì)MC3T3和MG63細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;5.囊泡相關(guān)膜蛋白(Vesicle associated membrane protein,Vapb)能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng),因此我們重點(diǎn)研究了Vapb,HEK293T細(xì)胞中的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-335可以靶向Vapb;6.RT-q PCR和VAPB抗體western blot分析檢測(cè)小鼠和細(xì)胞中Vapb水平。

結(jié)果顯示,EV處理抑制了Vapb水平,而miR-335抑制可以緩解Vapb的抑制;7.miRwalk、Target Scan、EvimcrRNA和Starbase的網(wǎng)站上預(yù)測(cè)并篩選了miR-335的7個(gè)靶基因(SMARCA2、Vapb、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2),通過文獻(xiàn)調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)囊泡相關(guān)膜蛋白(Vesicle associated membrane protein,Vapb)能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。使用RT-PCR和western blot鑒定過表達(dá)Vapb細(xì)胞的構(gòu)建情況,RT-q PCR顯示,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Vapb mRNA的表達(dá)明顯增加,使用VAPB抗體western blot在蛋白中觀測(cè)到了相似結(jié)果;MTT檢測(cè)細(xì)胞活力及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明,過表達(dá)Vapb細(xì)胞的細(xì)胞伴有細(xì)胞增殖率的下降和細(xì)胞凋亡的增加,表明Vapb過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Vapb過表達(dá)部分抵消了B-EVs對(duì)MC3T3和MG63細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。8.過表達(dá)Vapb可逆轉(zhuǎn)EVs對(duì)Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)的促進(jìn)。提示EVs中靶向Vapb的miR-335可能與Wnt和β-catenin通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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