背景[1-3]
IFITM1抗體是一種可以特異性結(jié)合IFITM1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的IFITM1蛋白。IFITM1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。
IFITM1誘導(dǎo)的抗病毒蛋白，可抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)，允許內(nèi)吞，但阻止隨后的病毒融合和病毒內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。對多種病毒具有活性，包括甲型流感病毒、SARS冠狀病毒（SARS-CoV）、馬爾堡病毒（MARV）、埃博拉病毒（EBOV）、登革熱病毒（DNV）、西尼羅河病毒（WNV）、1型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）?？梢种屏鞲胁《狙氐鞍捉閷?dǎo)的病毒進(jìn)入、MARV和EBOV GP1,2介導(dǎo)的病毒進(jìn)入以及SARS-CoV S蛋白介導(dǎo)的病毒進(jìn)入。還與細(xì)胞粘附和控制細(xì)胞生長與遷移有關(guān)。
IFITM1抗體
IFITM1抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。
3.轉(zhuǎn)膜與封閉
1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。
3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（IFITM1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(IFITM1抗體)。
3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應(yīng)用[4][5]
IFITM1抗體可以用于抗IFITM1單克隆抗體的制備及檢測
制備抗干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白-1(interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)的單克隆抗體,為檢測IFITM1及進(jìn)一步研究其在結(jié)腸腫瘤發(fā)生過程中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:以結(jié)腸癌患者的癌組織為材料,提取總RNA,以RT-PCR擴(kuò)增得到IFITM1 cDNA序列,經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后,克隆入pGEX-4T-3進(jìn)行原核表達(dá)并純化得IFITM1-GST;以該融合蛋白免疫BALB/c小鼠,淋巴細(xì)胞雜交瘤法制備單克隆抗體;采用IFITM1抗體ELISA、Western-blot及免疫組織化學(xué)法以制備的抗體檢測結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中的IFITM1。結(jié)果:成功構(gòu)建了IFITM1原核表達(dá)載體,獲得了IFITM1-GST重組蛋白;制備得到了1株抗IFITM1單克隆抗體,腹水ELISA效價(jià)為1:30000,抗體亞類為IgG1,可用于IFITM1抗體ELISA、Western-blot及免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中的IFITM1。結(jié)論:獲得了1株可用于ELISA、Western-blot及免疫組織化學(xué)法的抗IFITM1單克隆抗體2F-1,為進(jìn)一步研究IFITM1在結(jié)腸腫瘤發(fā)生過程中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
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