背景^[1-3]

KDEL抗體是一種可以特異性結(jié)合KDEL的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的KDEL蛋白。KDEL抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

KDEL抗體可作為非偶聯(lián)的抗KDEL ER標(biāo)記抗體使用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中的錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)引發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)。ER伴侶蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白會(huì)退出分泌途徑并被回收至ER，在此過程中，KDEL ER標(biāo)簽發(fā)揮著重要作用。KDEL代表ER C端四肽滯留信號(hào)（Lys-Asp-Glu-Leu）。這種特定的標(biāo)簽會(huì)阻止蛋白質(zhì)的分泌。這些蛋白質(zhì)的ER滯留是通過一種途徑實(shí)現(xiàn)的，該途徑涉及通過KDEL標(biāo)簽將逃逸的蛋白質(zhì)與ER后區(qū)室中的KDEL受體結(jié)合。然后，蛋白質(zhì)-受體復(fù)合物被運(yùn)送回ER。KDELR2是在高爾基體和ER之間循環(huán)的受體之一，將含有KDEL信號(hào)的蛋白質(zhì)返回ER。這在研究環(huán)境中可能是有用的，因?yàn)楹蠯DEL ER滯留信號(hào)的目標(biāo)蛋白質(zhì)可以與KDELR2共表達(dá)，并且會(huì)被重新分布到ER。

KDEL抗體

KDEL抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（KDEL抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(KDEL抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

KDEL抗體可以用于重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

通過選擇正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及兩株胃癌細(xì)胞株MKN-45及SGC7901[3],觀察重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,為c-Met陽性腫瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

觀察重組免疫毒素（IT）抗c-Met/PE38KDEL對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用并探討其作用機(jī)制,為胃癌的導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ)。

方法通過KDEL抗體Western Blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞MKN-45及SGC7901及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 c-Met的表達(dá)情況;分別用不同濃度IT處理胃癌細(xì)胞MKN-45及SGC7901及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1,CCK-8試劑盒檢測(cè)24、48h細(xì)胞增殖抑制率;[3H]-亮氨酸摻入法測(cè)定重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL對(duì)三種細(xì)胞5、24h蛋白合成抑制的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化;Caspase試劑盒檢測(cè)不同濃度重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL作用于細(xì)胞后caspase-3、caspase-8活性變化;最后通過Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)caspase-3活性的變化。

結(jié)果1.通過KDEL抗體Western blotting檢測(cè)胃癌細(xì)胞MKN-45,SGC7901及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的c-Met的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞MKN-45,SGC7901比正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的c-Met的表達(dá)量高,有顯著性差異（P<0.01）;2.經(jīng)不同濃度重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL作用后,兩株胃癌細(xì)胞的增殖率及蛋白合成都有明顯的降低,呈時(shí)間和劑量依賴性,當(dāng)重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL濃度為10 ng/ml與100 ng/ml時(shí),對(duì)兩株細(xì)胞的增殖率及蛋白合成抑制作用最強(qiáng)（P<0.01）;3.流式細(xì)胞學(xué)顯示,隨著重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL濃度的增加,兩株胃癌細(xì)胞凋亡率逐漸升高,MKN-45和SGC7901兩株細(xì)胞在重組免疫毒素抗c-Met/PE38KD濃度為50 ng/ml時(shí)凋亡率分別為19.19%（P<0.01）及27.37%（P<0.01）;4.caspase活性測(cè)定顯示,對(duì)照組相比,重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL濃度為100ng/ml時(shí)兩株胃癌細(xì)胞caspase-3都有顯著增高（P<0.05）,但caspase-8升高不如caspase-3顯著,說明caspase-3在重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程中可能發(fā)揮更為重要的作用。

參考文獻(xiàn)

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[2]Higher cytotoxicity of divalent antibody-toxins than monovalent antibody-toxins[J].JaeSeon Won;;PilWon Nam;;YongChan Lee;;MuHyeon Choe.Biochemical and Biophysical Research Communications,2009(1)

[3]Removal of B cell epitopes as a practical approach for reducing the immunogenicity of foreign protein-based therapeutics[J].Satoshi Nagata;;Ira Pastan.Advanced Drug Delivery Reviews,2009(11)

[4]Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies[J].Robert Kreitman.BioDrugs,2009(1)

[5]徐偉.重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D].南京醫(yī)科大學(xué),2011.