背景[1-3]
CIDEC抗體是一種可以特異性結合CIDEC的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CIDEC蛋白。CIDEC抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
CIDEC，即誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子C，別名FSP27。它是一種在小鼠脂肪細胞中首次分離得到的蛋白質，隨后在人類肝細胞、脂肪細胞等多種細胞中被發(fā)現，屬于CIDE家族。CIDEC在脂滴表面定位，通過在脂滴間形成特殊的孔/通道樣結構，促進脂質從小脂滴轉移到大脂滴，從而調節(jié)脂肪代謝和機體能量平衡。CIDEC不僅在促進脂肪儲存和脂滴體積增大中發(fā)揮作用，還在細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。CIDEC的異常表達與多種代謝性疾病相關，如肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝病等。
CIDEC抗體
CIDEC抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（CIDEC抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CIDEC抗體)。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
CIDEC抗體可以用于CIDEC在人脂肪細胞分化中的作用及其機制研究
研究CIDEC在人類脂肪細胞分化中的作用,期望為今后治療肥胖提供新的靶點。目的1、研究CIDEC的表達與脂肪細胞分化的關系;2、研究CIDEC的亞細胞定位;3、研究下調CIDEC表達對脂肪細胞分化的影響及機制。
方法：1、利用CIDEC抗體免疫組織化學、Real-time PCR和Western blot方法檢測CIDEC在不同發(fā)育階段的人胚胎脂肪組織以及不同分化程度脂肪腫瘤組織中的表達變化;2、構建CIDEC與熒光蛋白融合表達的質粒,利用脂質體轉染COS-7細胞,以確定CIDEC蛋白的亞細胞定位。3、體外原代培養(yǎng)人前脂肪細胞,并進行誘導分化,檢測不同分化階段CIDEC的表達水平。4、利用慢病毒siRNA沉默CIDEC的表達,以研究下調CIDEC表達對脂肪細胞分化的影響,并分析其機制。
結果：1、CIDEC的表達水平與脂肪細胞的分化相關采用CIDEC抗體免疫組織化學、Real-time PCR和Western blot方法比較了3例不同發(fā)育階段的胎兒脂肪組織中CIDEC的表達情況,同時檢測調控脂肪細胞分化關鍵分子PPARγ的變化。結果顯示,無論mRNA還是蛋白水平,CIDEC均呈現隨著分化成熟逐漸增高的趨勢,并且與PPARγ的表達趨勢完全一致。對30例人體正常脂肪組織和45例不同分化程度的脂肪腫瘤組織的免疫組織化學染色結果顯示,CIDEC隨著脂肪細胞分化程度降低而表達降低。采用Real-time PCR和Western blot方法的研究結果顯示,同正常脂肪組織相比,脂肪瘤中CIDEC的表達變化不顯著,而分化好的脂肪肉瘤、黏液型脂肪肉瘤及去分化脂肪肉瘤中CIDEC的表達均顯著降低(n=5,*p<0.05)。此外,通過體外實驗原代培養(yǎng)人前脂肪細胞,并誘導成為成熟脂肪細胞,隨著脂肪細胞的誘導分化成熟,CIDEC和PPARγ的表達水平同誘導前相比急劇升高(*p<0.05),同脂肪分化標志分子FABP4變化趨勢一致。以上體內、外實驗結果提示,CIDEC在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。
參考文獻
[1]Cideb,an ER-and Lipid Droplet-Associated Protein,Mediates VLDL Lipidation and Maturation by Interacting with Apolipoprotein B[J].Jing Ye;;John Zhong Li;;Yang Liu;;Xuanhe Li;;Tianshu Yang;;Xiaodong Ma;;Qing Li;;Zemin Yao;;Peng Li.Cell Metabolism,2009(2)
[2]Adipose tissue-organotypic culture system as a promising model for studying adipose tissue biology and regeneration[J].Shuji Toda;;Kazuyoshi Uchihashi;;Shigehisa Aoki;;Emiko Sonoda;;Fumio Yamasaki;;Meihua Piao;;Akifumi Ootani;;Nobuhisa Yonemitsu;;Hajime Sugihara.Organogenesis,2009(2)
[3]FSP27 contributes to efficient energy storage in murine white adipocytes by promoting the formation of unilocular lipid droplets[J].Nishino,Naonobu;Tamori,Yoshikazu;Tateya,Sanshiro;Kawaguchi,Takayuki;Shibakusa,Tetsuro;Mizunoya,Wataru;Inoue,Kazuo;Kitazawa,Riko;Kitazawa,Sohei;Matsuki,Yasushi;Hiramatsu,Ryuji;Masubuchi,Satoru;Omachi,Asako;Kimura,Kazuhiro;Saito,Masayuki;Amo,Taku;Ohta,Shigeo;Yamaguchi,Tomohiro;Osumi,Takashi;Cheng,Jinglei;Fujimoto,Toyoshi;Nakao,Harumi;Nakao,Kazuki;Aiba,Atsu;Okamura,Hitoshi;Fushiki,Tohru;Kasuga,Masato.Journal of Clinical Investigation,2008(8)
[4]Lipid droplets:FSP27 knockout enhances their sizzle[J].Puri,Vishwajeet;Czech,Michael P.Journal of Clinical Investigation,2008(8)
[5]李煩繁.CIDEC在人脂肪細胞分化中的作用及其機制研究[D].第四軍醫(yī)大學,2010.