背景^[1-3]

SMAD5抗體是一種可以特異性結(jié)合SMAD5的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的SMAD5蛋白。SMAD5抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

SMAD5，也稱為MADH5和JV5-1，是一種由BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）1型受體激酶激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑。SMAD5是一種受體調(diào)節(jié)的SMAD（R-SMAD）。它在TGF-β抑制人造血祖細(xì)胞增殖的信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。

SMAD5抗體

SMAD5抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（SMAD5抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(SMAD5抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

SMAD5抗體可以用于BMPR2/SMAD5信號(hào)通路對(duì)雞顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及類固醇激素合成的影響

以產(chǎn)蛋雞的正常發(fā)育卵泡和就巢雞的閉鎖卵泡進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并篩選可能參與調(diào)控雞卵泡發(fā)育的信號(hào)通路,然后在體外培養(yǎng)的雞顆粒細(xì)胞中干擾和過(guò)表達(dá)該通路中上下游關(guān)鍵基因后檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡以及類固醇激素合成的影響,并外源添加信號(hào)通路抑制劑后影響顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況,以期明確信號(hào)通路在雞卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育中的作用。

主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)產(chǎn)蛋雞正常卵泡和就巢雞的閉鎖卵泡進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后對(duì)比發(fā)現(xiàn)了200個(gè)表達(dá)差異顯著的基因,其中有131個(gè)上調(diào)基因和69個(gè)下調(diào)基因,SMAD5抗體結(jié)果顯示包括SMAD5與BMPR2。GO富集分析顯示在生物過(guò)程中主要與細(xì)胞活化調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞活化調(diào)節(jié)、白細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)和增殖關(guān)聯(lián)密切;細(xì)胞組分中主要為中間絲細(xì)胞骨架、免疫突觸等;分子功能主要為結(jié)合和催化活性。KEGG富集分析通路發(fā)現(xiàn),差異基因富集到的前20個(gè)通路主要是TGF-β信號(hào)通路、細(xì)胞粘聯(lián)分子(CAMs)等,其中TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

(2) 在體外培養(yǎng)的雞原代顆粒細(xì)胞中干擾BMPR2表達(dá)后,顯著提高了細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表達(dá)水平;CCK8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞增殖效率明顯升高;Ed U染色顯示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加;細(xì)胞中的凋亡相關(guān)因子(Caspase-3與Caspase-9)表達(dá)量顯著降低;促進(jìn)細(xì)胞中雌激素(E2)和孕酮(P4)的分泌以及相關(guān)基因CYP11A1和CYP19A1的表達(dá),以上結(jié)果表明BMPR2可抑制雞顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

(3)SMAD5抗體結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)的雞原代顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SMAD5,細(xì)胞增殖基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表達(dá)量和蛋白水平表達(dá)量均顯著降低,而凋亡相關(guān)基因Caspase-3與Caspase-9的表達(dá)量顯著上升;CCK8與Ed U檢測(cè)均顯著細(xì)胞增殖效率顯著降低,E4與P2的合成及其相關(guān)基因的m RNA表達(dá)量與蛋白水平表達(dá)量也顯著下降。然而,在細(xì)胞中干擾SMAD5表達(dá)后,得到與上述相反的結(jié)果。以上結(jié)果表明SMAD5可抑制雞卵泡顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(4)在體外原代顆粒細(xì)胞中干擾BMPR2表達(dá)后SMAD5抗體結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMAD5的表達(dá)量下降,可對(duì)BMP/SMAD信號(hào)通路造成抑制作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Vascular-Parenchymal Crosstalk Promotes Lung Fibrosis Through BMPR2 Signaling.[J].Yanagihara Toyoshi;Tsubouchi Kazuya;Zhou Quan;Chong Michael;Otsubo Kohei;Isshiki Takuma;Schupp Jonas C;Sato Seidai;Scallan Ciaran;Upagupta Chandak;Revill Spencer;Ayoub Anmar;Chong Sy Giin;DvorkinGheva Anna;Kaminski Naftali;Tikkanen Jussi;Keshavjee Shaf;ParéGuillaume;Guignabert Christophe;Ask Kjetil;Kolb Martin Rj.American journal of respiratory and critical care medicine.2023

[2]Expression Patterns and Gonadotropin Regulation of the TGF-βII Receptor(Bmpr2)during Ovarian Development in the Ricefield Eel Monopterus albus[J].He Zhi;Zheng Li;Chen Qiqi;Xiong Sen;He Zhide;Hu Jiaxiang;Ma Zhijun;Zhang Qian;He Jiayang;Ye Lijuan;He Liang;Luo Jie;Gu Xiaobin;Zhang Mingwang;Tang Ziting;Jiao Yuanyuan;Pu Yong;Xiong Jinxin;Gao Kuo;Lai Bolin;Yang Shiyong;Yang Deying;Yan Taiming.International Journal of Molecular Sciences.2022

[3]BMP/Smad Pathway Is Involved in Lithium Carbonate-Induced Neural-Tube Defects in Mice and Neural Stem Cells[J].Yang Aiyun;Li Shen;Zhang Yan;Wang Xiuwei;Guan Zhen;Zhu Zhiqiang;Liang Yingchao;Zhao Lijiao;Wang Jianhua.International Journal of Molecular Sciences.2022

[4]Leptin promotes primordial follicle activation by regulating ovarian insulin-like growth factor system in chicken.[J].Ahmadi Sadequllah;Ohkubo Takeshi.Endocrinology.2022

[5]王蘇文.BMPR2/SMAD5信號(hào)通路對(duì)雞顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及類固醇激素合成的影響[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2023.