免疫佐劑（immunoadjuvant）就是指先于抗原或與抗原同時(shí)應(yīng)用，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，能增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型，而本身無(wú)抗原性的物質(zhì)。隨著亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗獨(dú)特性抗體疫苗等各種新型疫苗的出現(xiàn)，免疫佐劑的研究也越來(lái)越被人們關(guān)注，臨床應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。這些新型疫苗雖然具有抗原性良好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐劑的使用。免疫佐劑是一類可以先于抗原或與抗原同時(shí)使用，能夠非特異地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，而自己本身并無(wú)抗原性的物質(zhì)。對(duì)于很多傳染病，因缺乏合適的佐劑而影響重組蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的發(fā)展。因此，對(duì)于傳染病的防控不僅是研發(fā)高效低毒的疫苗，免疫佐劑的研發(fā)也至關(guān)重要。
本文介紹了免疫佐劑的作用機(jī)理以及各種免疫佐劑的應(yīng)用概況，以期為研發(fā)低毒、高效的獸用佐劑提供參考。

1.免疫佐劑的作用機(jī)理

一般的說(shuō)，不同佐劑具有不同的效應(yīng)機(jī)制。1996年，關(guān)于免疫佐劑作用機(jī)制Gill等提出2-信號(hào)假說(shuō)，根據(jù)該假說(shuō)，Th細(xì)胞的起始反應(yīng)需要3個(gè)信號(hào)，分別是信號(hào)0、信號(hào)1和信號(hào)2，理論上，佐劑可以與這3個(gè)信號(hào)都作用，根據(jù)啟動(dòng)不同信號(hào)通路發(fā)揮作用，將佐劑分為A型、B型和C型佐劑，見(jiàn)圖1。A型佐劑是目前研究最多的，如單磷酰脂質(zhì)A（MPL），主要與信號(hào)0發(fā)生作用，通過(guò)激活抗原遞呈細(xì)胞（APCs）間接與信號(hào)2作用，引起細(xì)胞因子的分泌。B型佐劑，是非特異性佐劑，如鋁氫氧化物，通過(guò)在注射部位建立一個(gè)中轉(zhuǎn)站，從而增強(qiáng)抗原的遞呈作用，最終使局部抗原濃度增大，并通過(guò)APCs提高上調(diào)作用，它們的效應(yīng)基于信號(hào)1的放大。C型佐劑，它們的功能模式是通過(guò)與APCs上的共同刺激分子相互作用，引起信號(hào)2的增強(qiáng)。

免疫佐劑除了可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，在疫苗免疫中還起到儲(chǔ)存抗原的作用，還可以影響遞呈抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcells，DC），提高免疫應(yīng)答和有效的記憶性免疫。在機(jī)體中，DC通過(guò)監(jiān)測(cè)免疫環(huán)境來(lái)識(shí)別壞死細(xì)胞、受傷機(jī)體釋放的細(xì)胞因子和細(xì)菌等危險(xiǎn)信號(hào)。上述這些危險(xiǎn)信號(hào)都能激活DC，促進(jìn)帶有相應(yīng)受體的淋巴細(xì)胞通過(guò)淋巴管從淋巴結(jié)中遷移出來(lái)而產(chǎn)生初次免疫，有些免疫佐劑能夠誘導(dǎo)機(jī)體不同類別細(xì)胞因子的分泌，從而控制或者改變機(jī)體對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)類型。

圖1  佐劑作用機(jī)制

2.免疫佐劑的類型

2.1 天然來(lái)源佐劑

從天然植物中提取的某些成分經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該成分具有免疫佐劑的活性，因?yàn)榫哂衼?lái)源天然、毒性較低、代謝容易、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在免疫佐劑的研究中越來(lái)越被重視。

2.1.1 QuilA

QuilA是從南美皂樹(shù)樹(shù)皮中篩選到的具有佐劑活性的成分。大量研究表明其為既能使外源性抗原刺激機(jī)體Th1免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的佐劑。這一獨(dú)特的性質(zhì)使其成為亞單位疫苗、細(xì)胞內(nèi)病原體疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑。但是QuilA存在嚴(yán)重的毒副作用，可引起溶血、局部組織壞死，甚至全身不良反應(yīng)或中毒，其對(duì)小鼠致死量為100~125μg。研究表明QuilA 除了用于為某些絕癥設(shè)計(jì)的疫苗如癌癥疫苗和人免疫缺陷病重組疫苗等人用疫苗外，仍主要限用于口蹄疫疫苗和狂犬疫苗等獸用疫苗。2013年靖杰等以QuilA為佐劑的H1、H3亞型流感病毒多表位DNA疫苗免疫小鼠，進(jìn)行細(xì)胞免疫和體液免疫水平檢測(cè)，結(jié)果表明，該佐劑可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。2010年劉燕瑜等在豬O型口蹄疫疫苗添加QuilA佐劑，顯著提高了FMD疫苗免疫后豬VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體及血清中細(xì)胞因子的水平，顯著提高了T淋巴細(xì)胞增殖率，從而提高了對(duì)豬的免疫保護(hù)作用。

2.1.2 皂甙

天然植物中提取的皂甙（Saponins）也具有佐劑活性。研究發(fā)現(xiàn)其能夠與細(xì)胞膜上的膽固醇形成復(fù)合物，是抗原強(qiáng)有力的免疫佐劑。皂苷佐劑不僅可以促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖，提高NK細(xì)胞的殺傷活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力及其代謝功能；而且還可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性MHC-I抗原限制性CTL，并刺激分泌多種細(xì)胞因子，如IL-10、IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-8、TNF-α；此外還可提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)抗原的特異性抗體水平，并刺激產(chǎn)生IgG1、IgG2a和IgG2b抗體亞類。2010年曹發(fā)昊等制備O/W人參皂甙納米乳，其穩(wěn)定性良好，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的抗體產(chǎn)生能力，同時(shí)增強(qiáng)Th1和Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究還表明皂甙對(duì)豬丹毒疫苗、奶牛金黃色葡萄球菌疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗、雞新城疫疫苗、禽流感疫苗和口蹄疫疫苗均有顯著的佐劑作用，并且主要增強(qiáng)IgG2免疫反應(yīng)。

2.1.3 蜂膠

蜂膠是一種具有廣譜生物學(xué)活性的天然物質(zhì)，包含樹(shù)脂類化合物、多酚類化合物和多糖類化合物等，是一種天然的免疫增強(qiáng)劑。應(yīng)用蜂膠或配合抗原引入機(jī)體，既能引起特異性免疫應(yīng)答，又能啟動(dòng)非特異性防御機(jī)制，能刺激免疫系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)量，增強(qiáng)補(bǔ)體活性和吞噬細(xì)胞的能力。蜂膠佐劑疫苗保護(hù)率比鋁佐劑疫苗高出22%，接種后無(wú)不良反應(yīng)。蜂膠可以顯著提高CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞數(shù)量和血清中IL-4含量。鑒于蜂膠佐劑無(wú)副作用，免疫效力高，禽霍亂蜂膠疫苗在我國(guó)已試用推廣到全國(guó)30 多個(gè)省市區(qū)。2010年張旭研制出復(fù)方蜂膠納米乳佐劑-H9亞型禽流感滅活疫苗，結(jié)果表明，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高的抗體水平，并能激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，與油苗比較，免疫后產(chǎn)生抗體時(shí)間更早、滴度更高、細(xì)胞免疫水平高。沈志強(qiáng)等用蜂膠作為佐劑研制新城疫-減蛋綜合征蜂膠二聯(lián)滅活疫苗，結(jié)果表明，免疫后5天，新城疫和減蛋綜合征抗體效價(jià)都增強(qiáng)了，較傳統(tǒng)油苗提前了10天。還有以蜂膠作為佐劑研制的其他禽類和豬用疫苗，結(jié)果表明都能引起一個(gè)較早、較持久和強(qiáng)的免疫保護(hù)。

2.2 油乳佐劑

油乳佐劑可以使單一或者多種抗原產(chǎn)生高滴度抗體且免疫周期較長(zhǎng)，包被在油滴中的特異性抗原釋放緩慢，能連續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；油滴能誘發(fā)機(jī)體局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，有利于刺激免疫細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答；特異性抗原包被在油滴中，避免被體液中的酶迅速分解，降低抗原分解速度，延長(zhǎng)作用時(shí)間；油乳劑能將注射部位的特異性抗原經(jīng)淋巴系統(tǒng)運(yùn)送至全身的淋巴結(jié)和脾臟處，從而產(chǎn)生一種新刺激誘生抗體。

2.2.1 根據(jù)油料分類

根據(jù)油料的不同，油乳佐劑可以分為礦物油佐劑和非礦物油佐劑兩種。礦物油佐劑是將礦物油、乳化劑（如Span-80、Tween-80）及穩(wěn)定劑（如硬脂酸鋁）按一定比例混合制備而成的，主要包括弗氏佐劑、白油司本佐劑和ISA206等，其特點(diǎn)是不穩(wěn)定且粘稠、在體內(nèi)不能被代謝，毒副作用巨大；非礦物油佐劑的油料成分是花生油、角鯊?fù)?、角鯊烯等可代謝物質(zhì)，主要包括MF-59、佐劑-65和SAF系列等。MF59是以5%角鯊烯、0.5% Tween80和0.5% Span85組成的油包水納米油乳佐劑，它能在注射部位誘導(dǎo)局部免疫刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和其他固有免疫基因，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，誘導(dǎo)偏向Th2型免疫應(yīng)答，已應(yīng)用到流感亞單位疫苗中。佐劑-65是以花生油為基礎(chǔ)油相制成的W/O型佐劑，它能在注射部位形成油囊包后2~3個(gè)月消失，沒(méi)有潛在的致癌物質(zhì)。Woodhour等進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，除了注射部位的反應(yīng)外，并沒(méi)有引起其他病變，也沒(méi)有致突變性。

2.2.2 根據(jù)分散狀態(tài)分類

根據(jù)分散狀態(tài)的不同，可以將油乳佐劑分為水包油（O/W），油包水（W/O），水包油包水（W/O/W）三種類型，O/W型乳狀液安全性較高，但擴(kuò)散快，使得佐劑活性較低；油包水（W/O）型乳狀液能在注射部位貯存時(shí)間較長(zhǎng)，能給抗原提供短期及長(zhǎng)期的免疫增強(qiáng)作用，佐劑活性很高；雙相型（W/O/W）乳狀液的作用時(shí)間和活性都介于兩者之間，但穩(wěn)定性較差，容易轉(zhuǎn)化為W/O 型。影響乳化劑穩(wěn)定性的因素也有很多，比如親水親油平衡值（HLB）、乳化工藝等，將低和高HLB值的乳化劑混合使用能產(chǎn)生特別穩(wěn)定的界面膜，從而形成比較穩(wěn)定的乳化體系。油乳佐劑作為一個(gè)貯存庫(kù)，可以防止水相中的多肽被機(jī)體水解，從而達(dá)到緩釋和保護(hù)抗原的目的，油水乳劑有利于樹(shù)突狀細(xì)胞移向淋巴細(xì)胞并遞呈，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

圖2 油乳佐劑

2.3 細(xì)胞因子免疫佐劑

細(xì)胞因子（Cytokines，CK）是一類存在于人和高等動(dòng)物體中的由白細(xì)胞和其他細(xì)胞合成的異源性蛋白或糖蛋白，分子量約20kDa，一般以小分子分泌物形式釋放，可結(jié)合在靶細(xì)胞的特異受體上。目前研究發(fā)現(xiàn)的具有免疫佐劑效應(yīng)的細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素（IFN）等。

2.3.1 白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）

IL-2可引起T細(xì)胞增值和維持T細(xì)胞在體外的持續(xù)生長(zhǎng)，故曾稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。IL-2作為免疫佐劑可作用于多種免疫細(xì)胞，如包括T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等，對(duì)免疫應(yīng)答具有廣泛的上調(diào)作用。IL-2除誘導(dǎo)外周T細(xì)胞增值及抑制T細(xì)胞凋亡外，還具有刺激胸腺產(chǎn)生T細(xì)胞的作用。2013年Hu等研究發(fā)現(xiàn)IL-2能有效地增強(qiáng)小鼠骨髓細(xì)胞成熟，故IL-2可作為以樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）為基礎(chǔ)的疫苗佐劑。2011年Zhang等在口蹄疫病毒的模式抗原中，聯(lián)合IL-2和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子作為VP1重組蛋白的佐劑，結(jié)果表明聯(lián)合佐劑的使用可刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，與各佐劑單獨(dú)免疫相比具有更好的佐劑作用。

2.3.2 干擾素（Interferon，IFN）

IFN的免疫佐劑活性主要表現(xiàn)在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞分裂及抗腫瘤等方面。IFN具有廣譜的抗病毒作用，使病毒增值量減少，細(xì)胞損傷程度降低，其抗病毒活性較高。另外，IFN還能增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。IFN分子量小，可以自由出入細(xì)胞，作用無(wú)特異性。它能抗御各種病毒，但卻不能直接作用于病毒，而是促使宿主細(xì)胞阻止病毒生長(zhǎng)。當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，IFN可以促使細(xì)胞產(chǎn)生一種抗病毒蛋白質(zhì)（Antiviralprotein，AVP），此物質(zhì)可以有效地阻止宿主細(xì)胞為病毒譯制病毒蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抗病毒的作用。IFN的抗病毒作用非常明顯，只要細(xì)胞內(nèi)有IFN存在，一切病毒都不能增殖。2008年Cheng等在鴨瘟病毒弱毒疫苗中構(gòu)建IFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒，在注射疫苗前15d注射該表達(dá)質(zhì)粒，能顯著誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫，結(jié)果表明該表達(dá)質(zhì)粒是鴨瘟弱毒疫苗優(yōu)良的分子佐劑。另外，研究表明，IFN-α在對(duì)丙肝治療效果顯著。

2.4 新型免疫佐劑

2.4.1微生物來(lái)源佐劑

某些菌體及其成分、代謝產(chǎn)物等配合抗原可以起到明顯的佐劑作用，這類佐劑主要有革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）、分枝桿菌及其組成成分、革蘭氏陽(yáng)性菌的脂磷壁酸、革蘭氏陽(yáng)性菌、短小棒狀桿菌、酵母菌的細(xì)胞壁、白色念珠菌提取物、細(xì)菌的蛋白毒素（霍亂毒素、破傷風(fēng)毒素、白喉類毒素）、CpGDNA等。目前，多項(xiàng)微生物和腫瘤抗原的后期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，其在人醫(yī)上的安全性已得到證實(shí)。

2.4.2免疫刺激復(fù)合物

免疫刺激復(fù)合物（IS?COMs）是瑞典科學(xué)家Morein等在20世紀(jì)80年代研發(fā)的一類作為抗原傳遞系統(tǒng)的佐劑，它是由脂類、膽固醇、抗原及糖苷Quil-A組成的籠狀結(jié)構(gòu)，可通過(guò)表面疏水作用捕獲蛋白抗原，通過(guò)內(nèi)吞作用被APC攝取。用免疫刺激復(fù)合物技術(shù)來(lái)制備各種獸用的細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)疫苗已有大量研究，適用于豚鼠、豬、牛、狗、兔和綿羊等多種動(dòng)物，可以介導(dǎo)廣泛全面的免疫反應(yīng)，具有較強(qiáng)的免疫原性和安全性。

圖3 免疫刺激復(fù)合物

2.4.3 脂質(zhì)體佐劑

脂質(zhì)體是由一層或數(shù)層同化圓排列的連續(xù)脂質(zhì)分子組成的內(nèi)含水相空間而形成的，其成分主要是天然形成的磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，也含有膽固醇、硬脂酸胺、磷脂酸和二?；姿岬瘸煞郑字孽；溤介L(zhǎng)飽和程度越高，則佐劑性越強(qiáng)。脂質(zhì)體兼具佐劑和載體功能，類似細(xì)胞膜的微球體，能將抗原傳遞給合適的免疫細(xì)胞，具有靶向作用，脂質(zhì)體可以說(shuō)無(wú)毒、無(wú)免疫原性，且在體內(nèi)能降解，是一種良好的佐劑。李成文等研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌外膜蛋白亞單位脂質(zhì)體佐劑疫苗，能顯著提高血清抗體水平。脂質(zhì)體作為新型疫苗的佐劑也很成功，張靜等將輪狀病毒DNA 疫苗與脂質(zhì)體結(jié)合免疫小鼠后，血清IgA水平明顯升高。納米正電荷脂質(zhì)體將能順應(yīng)疫苗研究的發(fā)展方向，有助于提高蛋白質(zhì)疫苗和基因疫苗的細(xì)胞免疫效應(yīng)。

2.4.4 納米佐劑

納米佐劑是用納米級(jí)的粒子材料制成的佐劑。目前應(yīng)用于佐劑領(lǐng)域的納米材料包括氫氧化鋁、磷酸鈣和殼聚糖等等。納米材料具有比表面積大，吸附催化能力強(qiáng)等特點(diǎn)。與抗原結(jié)合后免疫動(dòng)物，可以提高抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的攝取、加工和提呈能力；誘導(dǎo)抗原通過(guò)MHC-I途徑產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答；還可以促進(jìn)組織細(xì)胞釋放細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。氫氧化鋁納米佐劑均勻性好，可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞攝取抗原能力，為實(shí)現(xiàn)有效的免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。Fifis等通過(guò)大量的動(dòng)物試驗(yàn)證明，羧化聚苯乙烯納米球吸附抗原后免疫動(dòng)物，主要誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。宋永煥等發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米顆粒可以刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2和IFN-α，從而引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3. 展望

免疫佐劑是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中的免疫調(diào)節(jié)劑，非特異性免疫刺激作用是使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的基本條件。隨著對(duì)油乳佐劑的深入研究，佐劑成分中礦物油的含量已降至很低，很大程度上降低了油乳佐劑中礦物油和多環(huán)芳烴的殘留而造成的潛在的安全性問(wèn)題。選擇可代謝油取代傳統(tǒng)的礦物油來(lái)制備更為安全、穩(wěn)定、有效的新型免疫佐劑是目前油乳佐劑研究的方向。理想的佐劑應(yīng)該是廣譜的，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞或體液免疫均有有效的激發(fā)作用、作用持久穩(wěn)定、免疫次數(shù)減少、副作用小或無(wú)副作用，同時(shí)便于生產(chǎn)和易于注射。尋找高效低毒的新型免疫佐劑，通過(guò)多種途徑開(kāi)發(fā)出低價(jià)、高效、安全性高、作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用小、抗原釋緩能力強(qiáng)新型佐劑以及其作用機(jī)理，是今后免疫佐劑的研究趨勢(shì)。