背景及概述^[1]

Stbl3感受態(tài)細(xì)胞來源于 HB101 E. coli strain，是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低低錯誤重組的概率。經(jīng)pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率108 cfu/μg DNA。

操作方法^[1]

1. 取100μl冰上融化的Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，加入目的DNA并用指尖輕輕撥打管底混勻(避免用槍吸打)，冰上靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

使用注意事項(xiàng)^[1]

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 混入目的DNA時應(yīng)輕柔操作。

3. Stbl3細(xì)胞生長速度快 8-10小時可見克隆。

4. 若用氨芐抗生素篩選，應(yīng)使用含100 mg/ml ampicillin的平板。

應(yīng)用^[2-3]

CN201110091757.2公開了一種可用于表達(dá)miR-122載體pSU6-miR-122的構(gòu)建方法及用途，其步驟是：a、化學(xué)合成寡核苷酸鏈，反義鏈與有義鏈互補(bǔ)，在5’端添加上AGCT以產(chǎn)生粘性突出末端；b、有義鏈、反義鏈退火,形成帶BamHI和HindIII粘性末端的片段；c、將片段連接至載體pSilencer-2.1-U6，載體由BamHI和HindIII雙酶切；d、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞；e、篩選陽性克隆，得到表達(dá)miR-122的載體pSU6-miR-122質(zhì)粒。該載體在抑制乙肝病毒的藥物中的用途，抗乙肝病毒感染效率高，特異性強(qiáng)，對正常細(xì)胞無毒性，對乙肝病毒復(fù)制的抑制率為85.2%。

CN201710935589.8公開了一種基于CRISPR-CAS9慢病毒載體的基因敲除試劑盒，該試劑盒包括線性化的CRISPR-CAS9慢病毒載體和對應(yīng)的T4連接酶及感受態(tài)細(xì)胞，其特征在于所述的線性化的CRISPR-CAS9慢病毒載體由核酸內(nèi)切酶處理的環(huán)狀載體構(gòu)成，所述的T4連接酶是優(yōu)化的T4連接酶，所述的感受態(tài)細(xì)胞是具有抑制重組特性的Stbl3感受態(tài)。該試劑盒能直接進(jìn)行CRISPR-CAS9慢病毒載體的構(gòu)建，其比國內(nèi)外商品化試劑盒操作方便、且構(gòu)建重組得速度快，可有效提高目前基于CRISPR-CAS9慢病毒載體的構(gòu)建效率，降低基因敲除的費(fèi)用。

主要參考資料

[1] Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞說明書

[2] CN201110091757.2 一種可用于表達(dá)miR-122載體pSU6-miR-122的構(gòu)建方法及用途

[3] CN201710935589.8一種基于線性化CRISPR?CAS9慢病毒載體基因敲除試劑盒及其應(yīng)用