背景及概述^[1]

RNAi是一種在dsRNA參與指導(dǎo)下，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的，具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象，它表現(xiàn)為這些基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了mRNA，但是很快被降解而不能在細(xì)胞內(nèi)積累，最終使相應(yīng)的基因得不到表達(dá)而表現(xiàn)基因沉默。RNAi現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，許多學(xué)者便對其形成機(jī)制進(jìn)行了大量研究。雙鏈RNA在線蟲中引起的RNAi現(xiàn)象不僅可以從雙鏈RNA的注射部位傳遞到線蟲的身體各處，而且還可以從線蟲的父代傳給子代。這些現(xiàn)象讓科學(xué)家們猜測，RNAi作用可能是由一類較穩(wěn)定的中間介質(zhì)來實現(xiàn)的。在生化方面的研究進(jìn)一步揭示了RNAi的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PostTranscriptionalGeneSilencing，PTGS）的機(jī)制。在用轉(zhuǎn)基因或病毒誘導(dǎo)出PTGS的植物中發(fā)現(xiàn)了一種長為25個核苷酸（25nt）小片段RNA分子。這些小片段RNA分子可以通過序列互補(bǔ)與相應(yīng)的mRNA結(jié)合，從而引起mRNA的降解，而在未發(fā)生PTGS的植物體內(nèi)則無此發(fā)現(xiàn)，揭示了這種小片段RNA與PTGS的發(fā)生有密切關(guān)系。之后，有人將外源性dsRNA加入果蠅胚胎提取物中，發(fā)現(xiàn)dsRNA的兩條鏈均被降解成21-23nt的RNA片段，這一過程不依賴于靶mRNA序列的存在，而含有這種片段的胚胎提取物又能將與dsRNA同源的mRNA降解成為21-23nt的小片段RNA，表明dsRNA降解形成的小片段RNA具有介導(dǎo)同源mRNA降解的作用。

RNAi載體設(shè)計與構(gòu)建包括設(shè)計與構(gòu)建兩個方面

1. RNAi載體設(shè)計與構(gòu)建中設(shè)計過程如下：有研究以pCDNA3.1(+)載體為基本骨架,在其轉(zhuǎn)錄單元的5’端添加了一個自剪切的HDV核酶用于切掉轉(zhuǎn)錄后的5’帽子和其基因編碼序列的3’端添加了一個自剪切的煙草環(huán)斑病毒發(fā)夾狀核酶用于將3’polyA切掉,又在發(fā)夾狀核酶下游添加了一個加尾信號BGHpA(牛生長激素加尾信號)。為了更加保險的防止通讀現(xiàn)象的發(fā)生在BGHpA加尾信號下游添加了一個自我剪切的煙草環(huán)斑病毒核酶和能夠延緩RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的人β-actin基因(Humanβ-actingene)減速序列。為以后用G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)長雙鏈干擾RNA的細(xì)胞系,又將整個結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到已經(jīng)改造好的裝有新霉素抗性基因(Neomycin)表達(dá)結(jié)構(gòu)的的pBluescriptⅡSK(+)載體中。

2. RNAi載體設(shè)計與構(gòu)建中構(gòu)建過程：RNAi載體的構(gòu)建需對各種載體質(zhì)粒進(jìn)行相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)修飾再通過使用T4連接酶進(jìn)行連接，而后進(jìn)行重組質(zhì)粒的連接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取，已及重組質(zhì)粒的酶切鑒定等一系列的過程。具體步驟如下：

1) pcDNAHDVCoTC載體的構(gòu)建

將已經(jīng)提取好的由上海生工合成合成的HDV序列并克隆到pBluescriptIISk的SacI和BamHI酶切位點(diǎn)之間的載體質(zhì)粒和pCDNA3.1（+）載體使分別同時用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHI雙酶切，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將兩個片段進(jìn)行連接，命名為pcDNAHDVCoTC。酶切反應(yīng)體系：在1.5mL離心管中加入以下試劑，建立60µL反應(yīng)體系：

37℃反應(yīng)3h后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。連接反應(yīng)體系：在1.5mL離心管中加入以下試劑，建立10µL反應(yīng)體系：

16℃連接過夜，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后16-18h后用滅菌牙簽挑取單克隆進(jìn)行畫線，同時將其投入加入抗生素的LB培養(yǎng)基的小玻璃試管，37℃劇烈搖菌過夜，按照前面敘述的質(zhì)粒提取方法進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取，及酶切鑒定。

2)pcDNAHDVCoTC-5RZ載體的構(gòu)建

用XhoⅠ和XbaI雙切構(gòu)建好的pcDNAHDVCoTC質(zhì)?；厥掌漭d體部分和前面已經(jīng)退火連接好的作為外源片段的HHRF片段，將兩者連接，獲得pcDNAHDVCoTC-5RZ載體。此處重組質(zhì)粒需測序鑒定，挑選2個單克隆送上海生工進(jìn)行測序。

3)pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物與T載體測序正確的陽性重組克隆質(zhì)粒（Humanβ-globingene-T）和測序正確的陽性重組克隆pcDNAHDVCoTC-5RZ質(zhì)粒同時用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ和PmeI雙酶切回收外源片段和載體片段，將兩者連接，獲得pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs載體。

4)pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP載體的構(gòu)建

將pIRES-Neo載體和鑒定正確的pcDNAHDVCoTC-5RZ-ACTPs重組克隆載體，同時使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoI雙酶切這兩個載體，并回收外源片段和載體片段將其兩者連接，獲得pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP載體。

5)pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NheI雙酶切構(gòu)建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-ACTP質(zhì)粒載體，回收其載體部分和前面已經(jīng)退火后形成互補(bǔ)片段HHRF作為外源片段，將其兩者進(jìn)行連接，獲得pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP載體。

6)Psv40Neo載體的構(gòu)建

用HindⅢ切割PMCS載體，回收酶切產(chǎn)物使用KlenowFragment補(bǔ)平后，再次回收補(bǔ)平產(chǎn)物后，再用XhoⅠ切割回收的補(bǔ)平產(chǎn)物，此回收產(chǎn)物作為載體片段與用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NheI雙酶切構(gòu)建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP質(zhì)粒載體回收的大約1.515Kb的外源片段，將兩者連接，獲得Psv40Neo載體。。選擇鑒定正確的克隆提好質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆靡员氵M(jìn)行后續(xù)試驗。

7)RNA干擾用PMCSHDVCoT-5RZ-PA-3RZ-ACTP載體的獲得

用SalⅠ切割鑒定正確的Psv40Neo載體，回收酶切產(chǎn)物使用KlenowFragment補(bǔ)平，回收補(bǔ)平產(chǎn)物再用BglⅡ切割回收的補(bǔ)平產(chǎn)物，此回收產(chǎn)物作為載體片段與用BglⅡ和PmeI雙酶切構(gòu)建好的pcDNAHDVCoTC-5RZ-PA-3RZ-ACTP質(zhì)粒載體回收的大約1.944Kb的外源片段，將兩者連接，獲得RNA干擾用PMCSHDVCoT-5RZ-EGFP-PA-3RZ-ACTP載體。

主要參考資料

[1]RNA聚合酶Ⅱ識別的啟動子表達(dá)長dsRNA的RNAi載體的設(shè)計與構(gòu)建