背景技術(shù)

鳥苷-5'-三磷酸二鈉鹽，即是鳥嘌呤-5'-三磷酸或三磷酸鳥苷 (GTP)。在生物化學(xué)的全名為9-β-D-呋喃核糖鳥嘌呤-5'-三磷酸，或者是9-β-D-呋喃核糖-2-氨基-6-氧-嘌呤-5'-三磷酸。GTP是DNA復(fù)制時(shí)的引物(Primer，其實(shí)是RNA)和轉(zhuǎn)錄(即是mRNA的生物合成)時(shí)的鳥嘌呤核苷酸的提供者。它是三羧酸循環(huán)中琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁徇^程中的能量載體，它可以和ATP相互轉(zhuǎn)換。是細(xì)胞的正常成分，參與許多生化反應(yīng)，其所含高能鍵為蛋白質(zhì)的生物合成(氨基酸的進(jìn)位和肽鏈的移位)提供能量。在細(xì)胞內(nèi)GTP在鳥苷酸環(huán)化酶的作用下所產(chǎn)生的cGMP與ATP所產(chǎn)生的cAMP共同對(duì)細(xì)胞功能起著互相制約的調(diào)節(jié)作用。

鳥苷-5'-三磷酸二鈉鹽作為含高能量基質(zhì)和多種酶的激活因子，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)和心血管等有著非常重要的作用。GTP可以調(diào)節(jié)Ca²⁺誘導(dǎo)的胰島素分泌，還可以刺激神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)等。雖然GTP在生理過程中具有很重要的作用，但由于其它三磷酸物質(zhì)的共存干擾，使得用簡(jiǎn)單的方法區(qū)分GTP與其結(jié)構(gòu)相似物(如三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷 酸腺苷(AMP)仍然是一個(gè)難題。本文利用PEI包覆Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)，不僅簡(jiǎn)便快速地實(shí)現(xiàn)了對(duì)GTP的高選擇性和高靈敏度檢測(cè)，而且有效區(qū)分了GTP與其結(jié)構(gòu)類似物如ATP、CTP、UTP、ADP和 AMP，并實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞中GTP的檢測(cè)，為GTP的檢測(cè)提供了新方法。

實(shí)驗(yàn)方法

1、量子點(diǎn)的合成

在50 mL的微波超聲波反應(yīng)瓶(異口瓶)中加入288mg ZnSO₄·7H₂O和10 mg Mn(CH₃COO)₂，用少量水溶解，再加入750mg用少量水溶解的PEI，用水調(diào)整最終溶液體積約為20mL。用6moL／L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0，將微波超聲波反應(yīng)瓶放入微波超聲波組合合成／萃取儀中。參數(shù)設(shè)定為目標(biāo)溫度60℃，微波功率500W，超聲波功率1000W，時(shí)間15min，該過程在氬氣氛圍中進(jìn)行。隨后加入2.5mL 0.4moL／L的NaS₂·9H₂O水溶液，反應(yīng)30min，得到PEI包覆的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)。在不加PEI的條件下重復(fù)上述操作，得到裸的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)作為對(duì)照。分別將所得的PEl包覆和裸的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)按體積比1：1加入無水乙醇使量子點(diǎn)沉降，10000r／min 離心10min，傾去上層清液，所得固體放入真空干燥箱中干燥24 h，得到實(shí)驗(yàn)所用的PEI包覆和裸的 Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)。

2、室溫磷光檢測(cè)

在10mL比色管中，依次加入1mL pH 7.2的0.1moL／L羥乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES)緩沖溶液和20ul 20 g/L PEI包覆的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)水溶液，以水稀釋定容至10mL并搖勻，依次加入不同濃度的GTP水溶液，靜置3min后檢測(cè)溶液的磷光(激發(fā)波長(zhǎng)為312 nm)。 

3、癌細(xì)胞提取液的制備

肝癌細(xì)胞中鳥苷-5'-三磷酸二鈉鹽按以下步驟提取：(1)HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇。從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中使其溶解，加入一定量的培養(yǎng)液，800r／min離心3min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液4mL，吹打使細(xì)胞懸浮。重復(fù)上述步驟3次，然后將含細(xì)胞的培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶中。 細(xì)胞密度控制在約5×10⁴個(gè)／mL，放入37℃ CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基，如果鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量很多，則進(jìn)行傳代；(3)HepG2細(xì)胞提取液的制備。首先選擇體外指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，消化后用血球計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)，總量為2.5×10⁷個(gè)／mL，然后以800r／min離心3min，并用預(yù)冷的PBS洗3次，800r／min離心3min，重懸于0.25 mL預(yù)冷的超純水中，在0℃超聲降解20min使細(xì)胞壁破裂。為去除溶解產(chǎn)物中的細(xì)胞碎片和蛋白，依次用Amicon ultra一4離心膜30kDa和3kDa離心分離(10000r／min×15 min)。將得到的癌細(xì)胞提取液準(zhǔn)確稀釋20倍用于檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]任呼博,楊成雄,嚴(yán)秀平. 微波-超聲波輔助合成聚乙烯亞胺包覆Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)用于室溫磷光檢測(cè)三磷酸鳥苷[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012,31(9):1042-1050.