牛腸激酶輕鏈簡(jiǎn)介^[1]

腸激酶（Enterokinase,EK）是存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶。在 pH 值（4.5～9.5）、溫度 4～45℃范圍內(nèi)專一識(shí)別 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，并水解 Lys 后肽鍵。由于經(jīng) EK 裂解融合蛋白所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N 末端氨基酸序列，因而可作為蛋白表達(dá)體系中融合蛋白的切割試劑。但是天然的腸激酶來(lái)源有限，價(jià)格昂貴，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易被其它蛋白酶污染，在切割融合蛋白的同時(shí)可能又降解了目的產(chǎn)物，運(yùn)用基因工程方法可以彌補(bǔ)這些不足。

牛腸激酶輕鏈生理特點(diǎn)^[1]

1939 年 Kunitz證實(shí)腸激酶是胰蛋白酶原的生理激活劑，而胰蛋白酶是消化系統(tǒng)其它許多酶原的激活劑，因此腸激酶被認(rèn)為是消化系統(tǒng)重要的起始酶之一。一般認(rèn)為EK 存在于小腸刷狀緣細(xì)胞膜上，Zamolodchikova等認(rèn)為 pro-EK 是由十二指腸酶激活的。病理研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸與胰腺的回流液中富集 EK 會(huì)激活過(guò)多的胰蛋白酶原從而導(dǎo)致急性胰腺炎，而 EK 缺陷的機(jī)體將會(huì)有腹瀉、嘔吐、浮腫等癥狀，造成發(fā)育不良，導(dǎo)致血蛋白不足癥和貧血。

重組牛腸激酶輕鏈在大腸桿菌中的表達(dá)和純化^[2]

經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化全基因合成了牛腸激酶輕鏈基因,采用pET-39b(+)構(gòu)建了融合表達(dá)載體,為有效純化和回收目標(biāo)蛋白,在sBEKLC的C末端添加了his標(biāo)簽.在大腸桿菌中進(jìn)行成功表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到151.2 mg/L DsbA-sBEKLC,相當(dāng)于80.6 mg/LsBEKLC.高表達(dá)的DsbA-sBEKLC融合蛋白雖然沒(méi)有生物活性,但可用于復(fù)性來(lái)得到活性sBEKLC.使用滲透沖擊技術(shù)從細(xì)胞周質(zhì)中提取蛋白,經(jīng)過(guò)親和層析可從每升發(fā)酵液中得到6.8 mgsBEKLC,sBEKLC經(jīng)檢測(cè)具有生物活性,為重組腸激酶在融合蛋白純化中的應(yīng)用提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)

[1] 牛腸激酶輕基因的克隆及其在大腸桿菌中的融合表達(dá)的研究

[2]重組牛腸激酶輕鏈在大腸桿菌中的表達(dá)和純化.黃磊