背景^[1-3]

細(xì)胞遷移指即細(xì)胞劃痕法，是測定細(xì)胞遷移運(yùn)動與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型。在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其他硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否生長至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力，實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等組別，通過不同分組之間的細(xì)胞對于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。

當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。

細(xì)胞遷移

實(shí)驗(yàn)方法

1、培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前先用marker筆在12孔板背面畫橫線標(biāo)記（方便拍照時(shí)定位同一個(gè)視野）。

2、細(xì)胞消化后接入12孔板，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜（數(shù)量少時(shí)可培養(yǎng)一段時(shí)間至鋪滿板底）。

3、細(xì)胞鋪滿板底后，用1ml槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致。（人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法的缺陷）。

4、吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板三次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。

5、加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。

6、將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔4-6小時(shí)取出拍照。

7、根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

應(yīng)用^[4][5]

細(xì)胞遷移可以用于NFIC1抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制的研究

探究了NFIC1對Luminal A型和三陰型乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響和相關(guān)機(jī)制。本研究將NFIC1的過表達(dá)質(zhì)粒和si RNA分別轉(zhuǎn)染入MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中,Wound healing和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)NFIC1能明顯抑制MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲;敲低NFIC1能顯著促進(jìn)MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力和對Matrigel膠的侵襲能力。

為了探究NFIC1抑制遷移和侵襲的分子機(jī)制,我們在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中分別瞬時(shí)過表達(dá)NFIC1后,對NFIC1過表達(dá)及其對照細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。對MCF7細(xì)胞測序結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn),對照組與過表達(dá)NFIC1組差異基因主要富集在由干擾素介導(dǎo)的Jak-STAT通路上。

隨后,我們證實(shí)了過表達(dá)NFIC1能促進(jìn)IFNL1、IFNL2/3和IFNB1的表達(dá)和分泌,同時(shí)也能激活Jak-STAT通路。接下來,我們在過表達(dá)NFIC1后使用Jak-STAT通路抑制劑Filgotinib和Ruxolitinib來阻斷Jak-STAT通路,發(fā)現(xiàn)阻斷Jak-STAT通路能逆轉(zhuǎn)NFIC1抑制MCF7細(xì)胞遷移和侵襲的效果。

進(jìn)一步根據(jù)測序結(jié)果,在過表達(dá)NFIC1的細(xì)胞中分別敲低Jak-STAT通路的下游靶基因MX1、MX2和RARRES3,發(fā)現(xiàn)敲低MX1和MX2能減弱NFIC1過表達(dá)對遷移和侵襲的抑制作用。最后,我們在過表達(dá)NFIC1同時(shí)分別敲低IFNL1、IFNL2/3和IFNB1,此時(shí)Jak-STAT通路受到明顯抑制、MX1和MX2的表達(dá)顯著降低、并且NFIC1抑制遷移和侵襲的作用也遭到削弱。

以上結(jié)果表明NFIC1在MCF7細(xì)胞中通過促進(jìn)IFNL1、IFNL2、IFNL3和IFNB1的表達(dá)激活了Jak-STAT通路,活化的Jak-STAT通路通過上調(diào)MX1和MX2的表達(dá)來抑制MCF7細(xì)胞的遷移和侵襲。通過對MDA-MB-231細(xì)胞測序結(jié)果中差異表達(dá)基因的篩選及驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)NFIC1能直接結(jié)合在S100A2啟動子區(qū)域從而上調(diào)S100A2的表達(dá)。

敲低S100A2能逆轉(zhuǎn)NFIC1對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的抑制效果。隨后我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NFIC1后MEK和ERK的磷酸化水平受到明顯的抑制,敲低S100A2能逆轉(zhuǎn)NFIC1對MEK/ERK通路的抑制狀態(tài)。進(jìn)一步,在MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)NFIC1同時(shí)敲低S100A2后,使用U0126抑制MEK/ERK通路能解除敲低S100A2對遷移和侵襲的逆轉(zhuǎn)效果。

同時(shí),過表達(dá)NFIC1上調(diào)S100A2后能通過抑制MEK/ERK通路來抑制MDA-MB-231細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果表明NFIC1在MDA-MB-231細(xì)胞中通過上調(diào)S100A2的表達(dá)來抑制MEK/ERK通路,進(jìn)而誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞由間充質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)化為上皮形態(tài),最終抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲。

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