背景^[1-3]

小鼠肝細(xì)胞是從對人TGFα進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的小鼠（CD1株，MT42系）的肝細(xì)胞中建立的貼壁上皮樣細(xì)胞。

通過電子顯微鏡，這些細(xì)胞表現(xiàn)出典型的肝細(xì)胞特征，例如過氧化物酶體和膽小管樣結(jié)構(gòu)。AML12細(xì)胞保留表達(dá)血清（白蛋白，α1抗胰蛋白酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白）和間隙連接（連接蛋白26和32）蛋白的高水平mRNA的能力，并且僅包含乳酸脫氫酶的同工酶5。細(xì)胞表達(dá)高水平的人TGFα和較低水平的小鼠TGFα。肝特異性蛋白的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，但會(huì)通過在無血清培養(yǎng)基中生長細(xì)胞而重新激活。

小鼠正常肝細(xì)胞系作為一個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?jīng)常為廣大科研工作者所接觸。細(xì)胞的培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)中起到根基作用，如何爭取的培養(yǎng)與使用，則是應(yīng)用實(shí)操的關(guān)鍵。

肝細(xì)胞為多角形，直徑約為20-30/加（微米），有6-8個(gè)面，不同的生理?xiàng)l件下大小有差異，如饑餓時(shí)肝細(xì)胞體積變大。

每個(gè)肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu)：如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基體、微粒體及飲液泡等組成。

小鼠肝細(xì)胞

小鼠肝細(xì)胞制備步驟：

1.斷頭處死成年小鼠，充分放血后迅速無菌取出肝臟組織，置于緩沖液中；

2.首先將肝組織剪成5mm邊長的組織塊，使用緩沖液洗滌2-3遍，然后進(jìn)一步將肝組織剪碎成1mm3的組織小塊，使用緩沖液沖洗直至上清澄清；

3.組織塊轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)，加入10ml消化液，37%，靜置消化1h，間隔15min搖動(dòng)1次；

4.消化完全后使用巴氏滴管反復(fù)吹打消化產(chǎn)物30次，消化物分別過80目、200目細(xì)胞篩，收集濾液；

5.1000rpm，室溫離心8min，收集細(xì)胞，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

6.600rpm，離心5min，重復(fù)離心純化2次，細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，按1x106/25cm2的細(xì)胞數(shù)分瓶，使用完全培養(yǎng)基+20%FBS進(jìn)行培養(yǎng)。

7.18h后換液，以后每天換液。

應(yīng)用^[4][5]

用于載鉛超細(xì)炭黑對CAT、SOD及小鼠肝細(xì)胞毒性效應(yīng)與機(jī)理的研究

選取小鼠原代肝細(xì)胞為靶細(xì)胞,選取CAT和SOD為靶蛋白,選取UFCB作為UFPs的生物替代模型,在細(xì)胞水平和分子水平研究比對了UFCB和載鉛UFCB誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激的效應(yīng)與機(jī)理。

主要包括以下幾部分內(nèi)容:（1）綜述了大氣顆粒物、UFPs、UFCB和鉛的污染現(xiàn)狀及現(xiàn)階段毒理學(xué)研究進(jìn)展,明確了現(xiàn)階段對載鉛UFPs毒性機(jī)理評價(jià)的不足,確定了本次的研究目的和研究內(nèi)容。

（2）利用多種方法對UFCB進(jìn)行改性修飾,改性后超細(xì)炭黑（MCB）水溶液的Zeta電位為-39.7 mV,遠(yuǎn)高于改性之前的-18.2 mV,證明MCB的分散穩(wěn)定性優(yōu)于改性之前。將MCB應(yīng)用于鉛的吸附實(shí)驗(yàn),最后得到鉛含量為0.235 g/g的載鉛MCB（即Pb-MCB）。

（3）研究比對了MCB和Pb-MCB誘發(fā)小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:肝細(xì)胞活力與MCB和Pb-MCB暴露濃度之間均呈負(fù)活力-劑量關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)MDA含量隨MCB和Pb-MCB暴露濃度的增加而升高,且在50 mg/L時(shí)達(dá)到最高,分別為對照組的204.44%和172.49%,高濃度的MDA打破了細(xì)胞內(nèi)部的氧化還原平衡并破壞了細(xì)胞膜的完整性,使細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用從而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低甚至死亡。隨著MCB和Pb-MCB暴露濃度的升高,細(xì)胞內(nèi)CAT的相對活力均呈先上升后下降的趨勢。MCB的暴露同樣導(dǎo)致了胞內(nèi)SOD的相對活性先上升后下降,但是隨Pb-MCB暴露濃度的增加,SOD的相對活性逐步上升。比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn),MCB的細(xì)胞毒性較Pb-MCB的細(xì)胞毒性強(qiáng),原因是MCB較Pb-MCB帶更多的負(fù)電荷,更易與膜蛋白、CAT和SOD結(jié)合作用,影響細(xì)胞和酶的活力及功能表達(dá)。

（4）利用多種光譜學(xué)手段研究比對了MCB和Pb-MCB的暴露對CAT和SOD分子結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):無論是MCB還是Pb-MCB都會(huì)與CAT和SOD結(jié)合,在炭黑顆粒表面形成一層“蛋白冠”類的物質(zhì),改變了CAT和SOD發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境,使蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)緊縮,疏水性增強(qiáng)。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持續(xù)下降。CAT和SOD活性的變化一方面說明了結(jié)構(gòu)的改變影響了酶的功能表達(dá);另一方面酶與MCB或Pb-MCB的結(jié)合會(huì)影響其活性位點(diǎn)附近氨基酸的微環(huán)境,從而間接對酶的活性產(chǎn)生影響或者抑制作用。

比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對CAT和SOD分子的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),MCB對CAT和SOD結(jié)構(gòu)和功能的影響大于Pb-MCB對兩種酶蛋白的影響,原因是MCB帶大量的負(fù)電荷,更易與帶正電荷的CAT或者SOD結(jié)合作用,改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促進(jìn)了Pb-MCB粒子的團(tuán)聚沉降,粒徑的增大使Pb-MCB與酶蛋白之間的作用力和結(jié)合面積減小,因此MCB較Pb-MCB表現(xiàn)出更強(qiáng)的分子毒性。

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