本文主要是提供一種實用的肝細胞提取方式，為從事病毒性肝炎、肝硬化和肝癌方面。以及少數從事肝臟的遺傳性代謝疾病、免疫性肝病、藥物和化學中毒性肝病、肝血管性疾病等研究者提供一些參考。

實驗方法 

小鼠肝臟的原位灌洗 用60ml注射器吸取已預溫至37℃ 的原代肝 細胞分離液 Ｉ 并連接好靜脈輸液針與注射器，并將 注射器固定在注射泵插槽內，白熾手術燈距其約20cm加熱，進行保溫。將預凍冰袋置于不銹鋼托盤 上。小鼠經脫臼處死后，立即用注射器針頭固定四 肢置于不銹鋼托盤的冰袋上，用 75％ 乙醇消毒腹部皮膚，“Ｕ”形切口剪開小鼠腹部、胸，并沿胸廓外沿剪開，完全剪開隔肌，暴露胸、腹器官，并可視心臟 下腔靜脈，用平口鑷將腹部臟器向右外側牽拉，暴露并識別肝門靜脈。步灌洗，用止血鉗結扎小鼠肝前靜脈及心臟下腔靜脈后，用靜脈輸液針穿刺肝后靜脈，進入約5mm，并同時用小動脈夾固定穿刺入針頭前端約3mm位置，剪開肝門靜脈，隨后開始灌注肝細胞分離液 Ｉ，設定流速為6ml／min，灌注體積為20ml／只，灌流方向從肝后靜脈進入，從肝門靜脈流出，行逆行灌注；可見肝門靜脈缺口有大量血液流出（如圖 １Ａ），并逐漸減少，肝臟完全變?yōu)橥粱疑?第二步灌洗，待步灌洗結束后，隨即改用已預溫至37℃ 的原代肝細胞分離液 ＩＩ 進行灌洗，設定流速為3ml／min，灌注體積為20ml／只，可見肝門靜脈缺口已無血液流出，液體清亮，肝臟逐漸變?yōu)橥咙S色（如圖 1B,體積明顯膨脹，用平口鑷輕觸肝臟表面可見不可復原小坑出現。

注：Ａ：步灌洗開始；   Ｂ：第二步灌洗結束。

 小鼠肝臟的酶消化 

用眼科手術剪無菌剝離全肝（去除膽囊部分）,經4℃ ，含 1％ FBS的無菌PBS溶液漂洗后，迅速轉至盛有已預熱至37℃ 的肝細胞分離液 ＩＩＩ 的 15ml 大玻璃平皿；將小鼠肝臟經眼科剪剪至大小1mm 3后轉入37℃水浴鍋消化15min；立即向每個肝臟加入5ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS）混勻，中止酶消化。 

單細胞懸液的制備 

消化處理后的肝組織懸液經100μｍ 細胞濾器過濾后，再經4℃ 的肝細胞分離用洗滌緩沖液補充體積至30ml，4℃，750ｒ／min，5min離心；吸棄上清，再加入5ml肝細胞分離用洗滌緩沖液，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌2次，目視上清無明顯渾濁出現。

肝細胞的密度梯度離心分離

 沿管壁加入5ml 10％ Opti Prep，用微量移液器吹打至獲得的細胞沉渣均勻分布，轉移至無菌15ml離心管內；再在上層加入5ml肝細胞分離用洗滌緩沖液，不混勻，標記并立即進行4℃，750ｒ／min，10min離心，吸棄上清后，再加入肝細胞分離用洗滌緩沖液2ml，４℃，750ｒ／min，2 離心洗滌，獲得肝細胞。

原代肝細胞的貼壁培養(yǎng) 

向獲得的肝細胞沉淀中加入1ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS）后，混勻，用細胞計數板計算細胞濃度，按接種密度為2×105個／ml立即接種于預包被有大鼠鼠尾膠蛋白的六孔板或細胞培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿所加培養(yǎng)基以視培養(yǎng)基厚度為1.6～1.8mm為準，于37℃ ，5％ co2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2h后細胞貼壁，吸棄上清，加入1ml DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS） 小心洗滌未貼壁細胞， 再加入DMEM培養(yǎng)基（含10％ FBS），37℃，5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（如圖 2）。

圖 ２ 肝細胞培養(yǎng) ２４ ｈ 后形態(tài)（ × ４０）

TC20 自動細胞計數儀計算 

分離后獲得的肝細胞純度檢測采用流式細胞檢測技術，對FITC標記細胞角蛋白18（ cytokeratin18）抗體（FITC?At18）標記的肝細胞進行分析，即分離后的肝細胞懸液約100μＬ，分別加入2支無菌15ml離心管內，標記為陰性對照 （negative control,NC）管和 FITC?At18標記的肝細胞（FITC?At18?HC） 管，再分別加入1ml 4％ 多聚甲醛，4℃，避光固定15min后，分別加入1ml PBS 溶液，混勻，4℃，750ｒ／min，3min離心，如此洗滌3次；加入3％BSA，４℃，封閉30min后，4℃，750ｒ／min，3min離心，吸棄上清，再加入 500μＬ 按FITC標記抗細胞角蛋白18抗體原液：3％BSA（V／V） ＝ 1∶300稀釋后的抗體，４℃，避光過夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液進行洗滌，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌3次，再加入200μＬPBS溶液，進行流式細胞儀檢測。

原代肝細胞的活力分析

分離肝細胞的活力分析（臺盼藍拒染實驗）：取0.2ml 4％臺盼藍母液，加入1.8ml PBS溶液中，稀釋為0.4％ 作為臺盼藍工作液。取分離后的原代肝細胞懸液約100μＬ 加入1支無菌1.5ml離心管４℃ ，封閉30min后，4℃，750ｒ／min，3min離心，吸棄上清，再加入500μＬ按FITC 標記抗細胞角蛋白18抗體原液：3％BSA（V／ V） ＝1:300稀釋后的抗 體，4℃，避光過夜孵育；次日，每次以1ml PBS溶液進行洗滌，4℃，750ｒ／min，3min離心，洗滌3次，再加入200μＬPBS溶液，進行流式細胞儀檢測。

原代肝細胞的活力分析 

分離肝細胞的活力分析（臺盼藍拒染實驗）：取0.2ml 4％ 臺盼藍母液，加入108ml PBS溶液中， 稀釋為0.4％ 作為臺盼藍工作液。 取分離后的原代肝細胞懸液約100μＬ加入1支無菌1.5ml離心管內，加入0.9ml 0.4％ 臺盼藍工作液，3min染色后，利用TC20自動細胞計數儀計數未被染色的細胞數，得活細胞數及活細胞率。

結果

純度分析通過TC20自動細胞計數儀計算，細胞濃度為5.95× 105 個／ml；從檢測結果來看，紅色為NC組，藍色為FITC?At18?HC組，測得FITC?At18?HC組陽性細胞百分比為 91.3％，表明初次分離獲得原代肝細胞純度為91.3％ （見圖 ３）。

圖 ３ 分離肝細胞的純度測定

從操作流程來看，常規(guī)肝細胞提取主要采用膠原酶浸泡的方法消化組織。該方法雖然操作簡單（無需灌注），但是浸泡消化的時間和強度不易掌握，得到的肝細胞質量不好（活力一般低于80%），不能滿足有些實驗的需求。因此本研究選擇了操作復雜但效果更好的酶灌注消化法。灌流在肝細胞提取中又是非常重要的環(huán)節(jié)，直接決定實驗所獲取細胞的質量。在實際操作中我們發(fā)現，小鼠門靜脈非常細小，不易穿刺。經過多次摸索，我們在兩步灌洗法的基礎上，優(yōu)化出一種更易操作的方法，即采用下腔靜脈進、門靜脈出的方式。下腔靜脈相對門靜脈更粗，因此方便穿刺操作。該改良方法相對降低了實驗的操作難度，降低了對實驗材料的要求（常見的靜脈輸液針即可滿足需求）。同時經改法獲得的肝細胞純度和活力均在90%以上，能夠滿足大多數的實驗需求。在實驗中我們也發(fā)現，該方法的主要不足之處在于灌流液體可從門靜脈流出，因而增大了細胞污染的幾率，故要求實驗者在操作時應小心謹慎。課題組在傳統(tǒng)肝細胞提取方法的基礎上，改變了灌流方式，得到了良好的實驗結果，為從事相關研究者提供參考。同時，建立和完善肝細胞長期培養(yǎng)技術將為人工生物肝臟研究及其臨床應用提供技術參考，具有重要意義。

原創(chuàng)單位：第三軍醫(yī)大學附屬醫(yī)院中心實驗室