背景^[1-3]

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC是從臍帶靜脈中分離出來(lái)的原代細(xì)胞。這種細(xì)胞是研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活（一種炎性反應(yīng)），并導(dǎo)致VCAM-1/CD106等細(xì)胞黏附分子上調(diào)，這些上調(diào)可使用熒光標(biāo)記抗體和細(xì)胞成像進(jìn)行定量。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（英Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）在進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常選用的細(xì)胞模型為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，簡(jiǎn)稱HUVECs)。而不是直接采用靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。原因是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的潛能，理論上可以傳代50-60次。

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC

細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中解凍至管內(nèi)殘留一點(diǎn)冰屑。用75%酒精擦拭凍存管后，將內(nèi)容物吸至一15ml無(wú)菌離心管中，逐滴加入預(yù)溫至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混勻，室溫1500rpm離心10分鐘棄上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗滌一次，離心后棄上清，加HUVEC完全培養(yǎng)液4－5ml備用，每支HUVEC凍存管含細(xì)胞量為5×10⁵個(gè)。

細(xì)胞接種培養(yǎng)

細(xì)胞接種：

（1）包被液：用去離水配制0.5%明膠溶液，過(guò)濾除菌。

（2）培養(yǎng)瓶包被：取2-4個(gè)T25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶加2－3ml0.5%明膠溶液，搖勻使包被液布滿培養(yǎng)瓶底面，置37℃2小時(shí)或放置過(guò)夜。

（3）接種細(xì)胞：接種前吸凈包被液，按2500－5000個(gè)細(xì)胞/cm接種細(xì)胞（1支5×10個(gè)細(xì)胞可接種2-4個(gè)培養(yǎng)瓶），每瓶加培養(yǎng)液3-5ml,搖勻后置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞已完全貼壁，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)在37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

（4）擴(kuò)大培養(yǎng)：一般每周更換培養(yǎng)液2次，至細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)面的70-80%可進(jìn)行傳代或凍存。

細(xì)胞凍存

調(diào)整細(xì)胞數(shù)2-5×10個(gè)/ml，按含細(xì)胞的RPMI-1640液ml數(shù)，配制等量的凍存液。凍存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含細(xì)胞的RPMI-1640液為8ml，應(yīng)配凍存液8ml，其中FBS為6.4ml,DMSO為1.6ml，混勻。置細(xì)胞懸液于冰浴中，逐滴加入凍存液，邊加邊搖動(dòng)。加完后用吸管吹打混勻。于冰浴中分裝細(xì)胞于凍存管中，1.8ml/管，再將凍存管置于凍存盒內(nèi)置-80℃冰箱，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

應(yīng)用^[4][5]

用于氯氮平對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷的影響研究

通過(guò)體外建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的高糖氧化應(yīng)激損傷模型,分析氯氮平對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷的影響,探討氯氮平是否可能通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,從而引起VTE的發(fā)生和發(fā)展。

方法：獲取新鮮的新生兒臍帶,0.1%Ⅰ型膠原酶灌注臍靜脈消化分離和培養(yǎng)HUVEC,采用倒置相差顯微鏡來(lái)觀察其形態(tài)及生長(zhǎng)狀況,免疫熒光法鑒定細(xì)胞,流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞純度,CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度葡萄糖(5.5、10、20、30、40、50、60 mmol·L-1)分別作用24、48、72小時(shí)后HUVEC活性的變化,根據(jù)結(jié)果選取的葡萄糖濃度和作用時(shí)間作為造模條件;CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度氯氮平(0、250、500、1000、1500、2000、300ng·m L-1)對(duì)HUVEC活性的影響以及高糖條件下不同濃度氯氮平對(duì)HUVEC活性的影響;ELISA檢測(cè)高糖條件下不同濃度氯氮平對(duì)HUVEC分泌氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）的水平的影響。

結(jié)果1.分離培養(yǎng)的HUVEC在倒置顯微鏡下貼壁生長(zhǎng),呈“鵝卵石”樣排列。免疫熒光鑒定血管性血友病因子（v WF）表達(dá)為陽(yáng)性,血小板-內(nèi)皮黏附分子（CD31）流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞純度達(dá)97.7%。

2. CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HUVEC活性（OD值）隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。在同一時(shí)間段,10 mmol·L-1葡萄糖時(shí)HUVEC活性較對(duì)照組升高,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;作用24小時(shí),20～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;作用48小時(shí),40～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;作用72小時(shí),各葡萄糖濃度間HUVEC活性沒(méi)有明顯差異（P>0.05）。成功建立了體外HUVEC的高糖（HG）損傷模型,最終選取30 mmol·L-1葡萄糖作用24小時(shí)作為造模條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. 與對(duì)照組比較,不同濃度氯氮平孵育24小時(shí)對(duì)HUVEC活性沒(méi)有明顯影響（P>0.05）;與高糖組比較,不同濃度氯氮平與高糖共同孵育24小時(shí)對(duì)HUVEC活性也沒(méi)有明顯影響（P>0.05）。

4.HUVEC經(jīng)高糖和氯氮平處理24小時(shí)后,500～3000 ng·m L-1氯氮平組ROS水平與高糖模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;1000～2000 ng·m L-1氯氮平組MDA水平與高糖模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而SOD及NO水平改變差異與高糖模型組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

參考文獻(xiàn)

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