背景[1-3]
Anti-NeuN(rabbit polyclonal)是以Anti-NeuN為抗原的多克隆抗體，可以特異性結(jié)合Anti-NeuN。Anti-NeuN(rabbit polyclonal)主要用于ICC/IF,Dotblot,ELISA,IHC-P,IHC-Fr,Immunomicroscopy,WB等Anti-NeuN檢測實驗。
抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原決定簇（表位）和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構(gòu)型所決定的。除兩者分子構(gòu)型高度互補外，抗原表位和抗體超變區(qū)必須密切接觸，才有足夠的結(jié)合力。
抗神經(jīng)元核抗體分為1型和2型，1型又稱為Hu抗體，2型又稱為Ri抗體。Hu的靶抗原存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)元，也存在于相關(guān)腫瘤細胞內(nèi)。Ri的靶抗原局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。
未發(fā)現(xiàn)正常人存在抗神經(jīng)元核抗體。Hu抗體比Ri抗體常見。臨床上常用間接免疫熒光法測定抗神經(jīng)元核抗體。間接免疫熒光法實驗原理將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。
步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。
第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
應用[4][5]
用于ERK-TRPV4通路在大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓致痛覺敏感中的作用機制研究
取實驗大鼠隨機分為5組,分別給予生理鹽水、shRNA 10^4病毒單位(toxic units,TU)、10^5 TU、10^6 TU和10^7 TU,每組各位6只大鼠。各組中,每只大鼠鞘內(nèi)注射體積均為10uL,連續(xù)注射3天。自第1天注射開始計算,第5天時,生理鹽水心臟灌注后取材。隨后利用Western Blot及RT-qPCR的方法,進行檢測并評價慢病毒鞘內(nèi)注射的效果從而確定慢病毒的注射滴度。
蛋白印記法測定CCD后DRG及脊髓背角組織中的蛋白表達手術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié)以及相應節(jié)段的脊髓背角,提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳法使蛋白分離,轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜,室溫封閉、一抗及二抗孵育后顯影。檢測鞘內(nèi)注射慢病毒干擾ERK后,DRG及脊髓背角組織中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表達變化。
實時定量熒光PCR測定DRG及脊髓背角組織中mRNA的表達變化手術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié)及相應節(jié)段的脊髓背角,快速取材,提取總RNA,測定濃度。利用Real-time quantitative PCR檢測DRG及脊髓背角組織中TRPV4、ERK1及ERK2的mRNA表達變化。各指標的引物序列同部分。
免疫共沉淀使用IP-WB裂解液,提取DRG和脊髓背角的組織總蛋白后,采用Prorein A-argarose方法,分別用anti-TRPV4抗體和anti-ERK抗體與之反應,進行免疫共沉淀結(jié)合。沉淀后的復合物利用蛋白印記法進行分析,分別觀察各組中是否存在所需目的蛋白。
脊髓和DRG的免疫組織化學染色一抗為:anti-NeuN多克隆抗體(小鼠抗大鼠,1:300,Abcam,USA);anti-ERK多克隆抗體(兔抗大鼠,1:500,CST,USA);anti-P-ERK多克隆抗體(兔抗大鼠,1:200,CST,USA);anti-TRPV4多克隆抗體(兔抗大鼠,1:200,Abcam,USA)。二抗為:辣根過氧化物酶標記-山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記-山羊抗兔IgG(北京義翹神州科技有限公司)。經(jīng)DAB顯染色和蘇木素染核后,觀察目的蛋白的組織定位。
參考文獻
[1]TRPV1-dependent ERK1/2 activation in porcine lens epithelium[J].Amritlal Mandal,Mohammad Shahidullah,Nicholas A.Delamere.Experimental Eye Research.2018
[2]MAPK Pathways Are Involved in Neuropathic Pain in Rats with Chronic Compression of the Dorsal Root Ganglion[J].Yu-Juan Qu,Lei Jia,Xiao Zhang,Hui Wei,Shou-Wei Yue,Haroon Khan.Evidence-Based Complementary and Alternative Medi.2016
[3]Effect of TRPV4-p38 MAPK Pathway on Neuropathic Pain in Rats with Chronic Compression of the Dorsal Root Ganglion[J].Yu-Juan Qu,Xiao Zhang,Zhen-Zhen Fan,Juan Huai,Yong-Bo Teng,Yang Zhang,Shou-Wei Yue,Akio Hiura.BioMed Research International.2016
[4]Ca 2+influx mediates the TRPV4–NO pathway in neuropathic hyperalgesia following chronic compression of the dorsal root ganglion[J].Jie Wang,Xiao-Wei Wang,Yang Zhang,Cui-Ping Yin,Shou-Wei Yue.Neuroscience Letters.2015
[5]賈磊.ERK-TRPV4通路在大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓致痛覺敏感中的作用機制研究[D].山東大學,2019.