背景及概述^[1][2]

靈芝含有豐富的活性成分，以多糖和屬三萜類的靈芝酸為主要活性成分。藥理研究顯示靈芝多糖具有抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化等作用；靈芝酸C2可抑制腫瘤細胞、艾滋病毒以及細菌。當(dāng)前靈芝多糖等靈芝活性物質(zhì)生產(chǎn)主要依賴人工栽培子實體為原料以提取的方法獲取，具有產(chǎn)率低、難以規(guī)?；a(chǎn)以及不同批次間活性成分組成及含量有較大差異等缺點。

檢測方法^[1]

靈芝酸C2是一類高度氧化的羊毛甾烷衍生物，主要有高效液相色譜法、香草醛-高氯酸比色法和紫外吸收法等3種分析方法。高效液相色譜法的優(yōu)點在于其可同時分析不同單體靈芝酸含量以及樣品制備過程相對簡單，但儀器昂貴、不易操作以及試劑要求高；紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法由于所需儀器設(shè)備簡單成為靈芝酸分析的主要方法。紫外吸收法通常以靈芝酸A和百里酚為靈芝酸對照品以定量分析；香草醛-高氯酸比色法主要以熊果酸和齊墩果酸作為參比物進行分析。但是利用紫外可見光譜分析不同靈芝酸及對照品差異，以不同對照品利用紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法分析靈芝發(fā)酵菌絲及子實體靈芝酸含量，是沒有的。

靈芝酸C2

制備^[2]

（1）稱取靈芝浸膏副產(chǎn)物原料，加一定量的無水乙醇，比例為1:5，超聲溶解，溶液離心后取上清液過0.45μm濾膜，得靈芝原液，供中壓制備用；

（2）Flash中壓制備收集到的液體上HPLC測定，分別得到靈芝酸A、B、C2混合物，水浴蒸干，供高壓制備備用；

（3）靈芝酸A、B、C2混合物蒸干后，加入適量甲醇溶解，過膜，濾液進行高壓制備純化，Prep高壓制備收集到的液體上HPLC測定，分別得到靈芝酸單體，再進行重結(jié)晶，得到靈芝酸純品。

以下以具體實驗為例進行說明：

（1）樣品前處理取20g靈芝浸膏副產(chǎn)物研磨，加100mL無水乙醇（或甲醇），超聲1h，溶液于7800r·min-1，離心10min。取上清液過0.45μm濾膜，得棕褐色副產(chǎn)物溶解液，備用。

（2）中壓制備靈芝酸粗提物Flash中壓制備色譜條件：Grace色譜柱C18-WP（40g，20μm）；以乙腈-0.05%醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫；Flash模式下色譜條件：流速25mL/min，運行時間10min，紫外檢測波長254nm，進樣約1.2mL；梯度洗脫程序：乙腈-0.05%醋酸溶液：0～4min：45%乙腈；4～4.01min：45%~55%乙腈；4.01～10min，55%乙腈。收集到的液體上HPLC測定，分別得到靈芝酸A、B、C2混合物，水浴蒸干備用。

（3）高壓制備靈芝酸提物靈芝酸A、B、C2混合物蒸干后，加入適量甲醇溶解，過0.45μm濾膜，濾液進行高壓制備純化。Prep高壓制備色譜條件：Waters制備色譜柱（SunFireTMPrepC18OBDTM5μm19*150mm）；以乙腈-0.05%醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫；Prep模式下色譜條件：流速13mL/min，運行時間43min，平衡時間3min，紫外檢測波長254nm，進樣約1mL；梯度洗脫程序：乙腈-0.05%醋酸溶液：0～29min：30%乙腈；29～36min：30%～50%乙腈；36～36.1min，50%～90%乙腈；36.1～43min，90%乙腈。收集到的液體上HPLC測定，分別得到靈芝酸A、靈芝酸B和靈芝酸C2，水浴蒸干。重結(jié)晶提純后，經(jīng)高效液相色譜鑒定，靈芝酸A、靈芝酸B和靈芝酸C2純度均大于98%。

主要參考資料

[1] 董虹玲, 夏廣萍, 趙娜夏, 白秀秀, 邵澤艷, & 韓英梅. (2013). Hplc法測定靈芝子實體和孢子粉中靈芝酸c2,靈芝酸g和靈芝酸a. 現(xiàn)代藥物與臨床, 28(1), 41-43.

[2] 吳慧慧, 唐珊珊, 周茜, & 陳作紅. (2016). 靈芝酸c2對鵝膏毒肽中毒小鼠肝組織細胞凋亡的影響.

[3] 吳禾, 劉曄, & 姜華. (2006). 紫外分光光度法測定靈芝及調(diào)脂靈中總靈芝酸的含量. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 22(1), 74-76.