背景[1-3]
FITC標(biāo)記的CD30抗體是一類(lèi)可以特異性結(jié)合CD30的多克隆抗體，主要用于檢測(cè)CD30的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
免疫熒光bai技術(shù)是將熒光素如異硫氰du酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)與相應(yīng)抗體（zhi或抗原）以化學(xué)的方法結(jié)合，將dao熒光標(biāo)記抗體（或抗原）與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原結(jié)合形成熒光標(biāo)記的抗體-抗原復(fù)合物，用熒光顯微鏡觀察。在鏡下見(jiàn)到有熒光存在即推斷有抗原抗體復(fù)合物的存在，根據(jù)已知的抗體（或抗原）即可推知另一個(gè)未知抗原（或抗體）的存在。
檢測(cè)原理：雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中CD30水平。用純化的CD30抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入CD30，再與HRP標(biāo)記的CD30抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CD30呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中CD30濃度。
CD30是TNF受體超家族的成員。該受體通過(guò)活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)，但不通過(guò)靜止的T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)。TRAF2和TRAF5可以與該受體相互作用，并介導(dǎo)導(dǎo)致NF-κB活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。該受體是細(xì)胞凋亡的正調(diào)節(jié)劑，并且還顯示出它可以限制自身反應(yīng)性CD8效應(yīng)T細(xì)胞的增殖潛能并保護(hù)人體免受自身免疫。
應(yīng)用[4][5]
用于靶向CD30抗體偶聯(lián)藥物的制備及其抗淋巴瘤活性研究
通過(guò)基因工程技術(shù)將LDP偶聯(lián)到抗CD30抗體的輕鏈N端,構(gòu)建融合蛋白anti-CD30-LDP,并采用CHO表達(dá)系統(tǒng)獲得目的蛋白。通過(guò)ELISA、Biacore、流式細(xì)胞術(shù)等方法驗(yàn)證融合蛋白與重組CD30抗原及CD30+腫瘤細(xì)胞的親和活性,通過(guò)免疫熒光共聚焦檢測(cè)其能否通過(guò)抗原介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,并通過(guò)活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)其在荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性。
在此基礎(chǔ)上,將活性發(fā)色團(tuán)AE與anti-CD30-LDP進(jìn)行組裝,獲得ADC藥物anti-CD30-LDM,通過(guò)CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其體外細(xì)胞殺傷活性和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,并通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)Karpas299移植瘤模型的抗腫瘤效果。研究結(jié)果:本研究應(yīng)用CHO細(xì)胞表達(dá)體系,從大量單克隆細(xì)胞中篩選獲得高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
經(jīng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)和Protein G親和層析柱分離純化,得到融合蛋白anti-CD30-LDP,HPLC檢測(cè)蛋白的純度大于98%。ELISA、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明融合蛋白與重組CD30抗原及CD30+腫瘤細(xì)胞都具有很強(qiáng)的親和性和特異性;通過(guò)Biacore實(shí)驗(yàn)計(jì)算其與重組CD30抗原的平衡解離常數(shù)為2.08 nmol/L,免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)表明融合蛋白能通過(guò)抗原介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。小動(dòng)物活體成像也表明融合蛋白在荷瘤小鼠體內(nèi)具有很好的腫瘤靶向性,并延長(zhǎng)了LDP在腫瘤部位的滯留時(shí)間。
組裝發(fā)色團(tuán)AE后,anti-CD30-LDM對(duì)CD30+細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖抑制和殺傷活性,IC50值(半數(shù)抑制濃度,half-maximal inhibitory concentration)在0.005～0.05 nmol/L之間,并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,anti-CD30-LDM給藥劑量為0.7mg/kg時(shí)抑瘤率為87.76%,并且無(wú)明顯毒副作用。
參考文獻(xiàn)
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