背景^[1-3]

ATP調(diào)節(jié)鉀離子通道ROM K抗體可以特異性結(jié)合ATP調(diào)節(jié)鉀離子通道ROM K的多克隆抗體?？贵w的組成極為復(fù)雜，是由成千上萬(wàn)、多種多樣的免疫球蛋白（Ig）分子所組成。這些Ig分子在形狀、大小、結(jié)構(gòu)以及氨基酸的組成和排列上，既相似，又有差別。由于有差別，它們的電泳活性就有很大的變化。因?yàn)榭贵w具有與抗原決定簇相對(duì)應(yīng)的結(jié)合部位（抗原結(jié)合簇），所以抗體與抗原的結(jié)合具有特異性。另一方面，抗體本身是一種蛋白質(zhì)，具有本身的氨基酸組成、排列和立體結(jié)構(gòu)，對(duì)異種動(dòng)物來(lái)說(shuō)，它又是抗原。

ATP調(diào)節(jié)鉀離子通道ROM K蛋白是完整的膜蛋白和內(nèi)向整流型鉀通道。它被內(nèi)部ATP激活，可能在鉀穩(wěn)態(tài)中起重要作用。編碼的蛋白質(zhì)具有更大的趨勢(shì)，允許鉀流入細(xì)胞而不是流出細(xì)胞。該基因的突變與產(chǎn)前Bartter綜合征有關(guān)，該綜合征的特征是食鹽浪費(fèi)，低鉀性堿中毒，高鈣尿癥和低血壓。已經(jīng)為該基因發(fā)現(xiàn)了編碼不同同工型的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物變體。

應(yīng)用^[4][5]

用于配體門(mén)控鉀離子通道MthK的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究

鉀離子通道是分布廣泛且十分重要的一類(lèi)離子通道。在機(jī)體的生命活動(dòng)過(guò)程中扮演著十分重要的作用,如膜電位的發(fā)生、神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)、心臟搏動(dòng)、平滑肌蠕動(dòng)、骨骼肌收縮、激素分泌等。配體門(mén)控的鉀離子通道是鉀離子通道里面的一大類(lèi)。MthK通道是從一種叫Methanobacterium thermoautotrophicum的古生甲烷桿菌里發(fā)現(xiàn)的一種鈣激活的配體門(mén)控鉀離子通道。以MthK為研究對(duì)象,通過(guò)生物化學(xué)方法,結(jié)合X-射線(xiàn)晶體學(xué)的研究手段,針對(duì)離子通道領(lǐng)域普遍關(guān)注的相關(guān)重要科學(xué)問(wèn)題：MthK通道的門(mén)控機(jī)制以及其通道膜孔的異常摩爾分?jǐn)?shù)效應(yīng)(AMFE)機(jī)制,進(jìn)行了探索性的研究。

本論文擬采用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析MthK離子通道蛋白在封閉狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)、帶有一個(gè)突變(F232A)的門(mén)控環(huán)及其通道孔部分在三種離子組合(K+/T1+,Tl+/Na+,Na+/K+)不同的摩爾分?jǐn)?shù)下的結(jié)構(gòu),以期能夠從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度闡釋MthK完整的門(mén)控機(jī)制以及離子通道領(lǐng)域一個(gè)二十多年的迷題——異常摩爾分?jǐn)?shù)效應(yīng)的分子機(jī)制。

本研究的內(nèi)容包括：運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)MthK基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)突變體MthK蛋白；運(yùn)用親和層析、分子排阻凝膠層析等手段純化MthK全長(zhǎng)蛋白、突變(F232A)門(mén)控環(huán)和MthK通道孔突變體(S68R,V77C);通過(guò)坐滴氣相擴(kuò)散法篩選蛋白晶體；通過(guò)條件梯度方法優(yōu)化晶體；晶體衍射。

本研究結(jié)果包括：1.將原核鉀離子通道蛋白MthK的基因(對(duì)應(yīng)氨基酸序列：E96-Q103)進(jìn)行突變克隆,構(gòu)建表達(dá)載體；2.用原核系統(tǒng)表達(dá)蛋白,獲得大量高純度MthK突變體重組蛋白。

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