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IPSCS標志物檢測的應用

2020/10/26 11:48:42

背景[1-6]

IPSCS標志物檢測是通過對IPSCS標志物的進行生物檢測以鑒定IPSCS的分化程度及功能的一種手段。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)是把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體,然后引入小鼠成纖維細胞,發(fā)現可誘導其發(fā)生轉化,產生的iPS細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,PSCs)技術是指通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。分化的細胞在特定條件下被逆轉后,恢復到全能性狀態(tài),或者形成胚胎干細胞系,或者進一步發(fā)育成新個體的過程即為細胞重編程(Cell reprogramming)。

分化是基因選擇性表達的結果,并沒有改變遺傳物質,而重編程在某種意義上就是分化的一個逆轉。與經典的胚胎干細胞技術和體細胞核移植技術不同,PSCs技術不使用胚胎細胞或卵細胞,因此沒有倫理學問題。此外,利用IPSCS技術可以用病人自己的體細胞制備專有的干細胞,從而大大降低了免疫排斥反應發(fā)生的可能性。iPSCS的岀現,在干細胞、表觀遺傳學以及生物醫(yī)學等研究領域都引起了強烈的反響,使人們對多能性的調控機制有了突破性的新認識,進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離。

iPSCS在細胞替代性治療以及發(fā)病機理的研究、新藥篩選以及神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病等臨床疾病治療等方面具有巨大的潛在價值。IPSCS標志物是在IPSCS分化完成后才能生產的特異性物質包含RNA、蛋白及其他物質。通過檢測這些特異性物質就可以了解到細胞的分化程度這對后續(xù)的實驗有著指導性的作用。

應用[7][8]

用于白內障患者誘導性多能干細胞(iPS)的建立及其定向分化的研究

白內障摘除聯合人工晶狀體(intraocular lens,IOL)植入是目前治療白內障最常用且效果較為理想的方法,而后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO)是影響病人術后遠期視力預后的最常見的并發(fā)癥,其術后5年的發(fā)生率高達30%左右。

體細胞誘導成為多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究成果被國際生命科學界譽為具有里程碑意義的創(chuàng)新之舉。方法正常人晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于角膜移植術后供體眼的晶狀體囊膜,年齡相關性白內障晶體上皮細胞培養(yǎng)取材于白內障超乳手術中撕除的晶體前囊膜。取年齡相關性白內障患者的皮膚組織,剪成1mm3大小的組織塊,過夜消化,離心收集細胞,經多次傳代后,獲得較為純化的皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下對三種細胞進行形態(tài)學觀察。采用CCK-8法連續(xù)7天測定三種細胞的增殖速率,繪制生長曲線并進行比較。結果正常人晶體囊膜組織塊貼壁48~72小時后可見人晶狀體上皮細胞從組織塊邊緣長出,約10~15天達到融合。初期正常人晶體上皮細胞為多角形,胞體透亮,細胞邊界清晰。融合后的細胞具有上皮細胞的形態(tài)特征,為典型的六角形或多邊形。

分別構建表達OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體(Lentivirus),并轉染年齡相關性白內障患者體外培養(yǎng)的晶體上皮細胞,誘導建立患者來源的誘導性多能干細胞,與同一患者來源的皮膚成纖維細胞對比,觀察限定因子對于誘導多能干細胞的誘導效率。分別將含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體質粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同輔助質粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T細胞,重組包裝構建慢病毒載體(分別為Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4).將構建的三種慢病毒載體混合分別感染第2代的白內障晶體上皮細胞和人皮膚成纖維細胞,培養(yǎng)5天后,與小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)進行共培養(yǎng),直至出現iPSCs。

對誘導建立的白內障患者來源的誘導性多能干細胞(iPSCs)進行鑒定,檢測細胞的分子標記及體內外分化能力,評價其多能性。方法對已成功誘導的白內障患者來源的iPSCs進行多能性鑒定:基因表達、免疫熒光染色分析、RT-PCR檢測、體外分化擬胚體、體內分化畸胎瘤檢測。提取iPSCs、ESCs和白內障患者晶體上皮細胞的總RNA采用HG-U133-2array(Affymetrix)對三種細胞的全基因表達譜進行檢測并進行對比。

參考文獻

[1]Differential effects of planktonic and biofilm MRSA on human fibroblasts[J].Garth A.James,John E.Olerud.Wound Repair Regen.2012(2)

[2]Prospect of Induced Pluripotent Stem Cell Genetic Repair to Cure Genetic Diseases[J].Jeanne Adiwinata Pawitan,Rajarshi Pal.Stem Cells International.2012

[3]Potential rescue,survival and differentiation of cancer stem cells and primary non-transformed stem cells by monocyte-induced split anergy in natural killer cells[J].Anahid Jewett,Han-Ching Tseng.Cancer Immunology,Immunotherapy.2012(2)

[4]Noggin[J].Carola Krause,Asja Guzman,Petra Knaus.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2011(4)

[5]Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells[J].Katsuhiko Hayashi,Hiroshi Ohta,Kazuki Kurimoto,Shinya Aramaki,Mitinori Saitou.Cell.2011(4)

[6]The lens:a classical model of embryonic induction providing new insights into cell determination in early development[J].Lena Gunhaga.Philosophical Transactions of the Royal Society B.2011(1568)

[7]Bone morphogenetic protein 7(BMP7)mutations are associated with variable ocular,brain,ear,palate,and skeletal anomalies[J].Alexander W.Wyatt,Robert J.Osborne,HelenStewart,Nicola K.Ragge.Hum.Mutat..2010(7)

[8]邱曉頔.白內障患者誘導性多能干細胞(iPS)的建立及其定向分化的研究[D].復旦大學,2012.

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