生物素3' 末端DNA標(biāo)記試劑盒

生物素3'末端DNA標(biāo)記試劑盒(Biotin 3' End DNA Labeling Kit)是一種通過(guò)Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素標(biāo)記的dUTP添加到DNA 3'末端的試劑盒。通常DNA的3'末端被標(biāo)記后不會(huì)干擾雜交反應(yīng)，也不會(huì)干擾基于序列特異性蛋白結(jié)合的EMSA檢測(cè)；因此生物素標(biāo)記的DNA探針可以用于常規(guī)的Northern、Southern、EMSA(即gel shift)以及colony hybridization或原位雜交等。
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)可以在不依賴(lài)于模板的情況下催化在DNA的3'-OH端加上dNTP的反應(yīng)。關(guān)于TdT催化雙鏈DNA末端加dNTP的反應(yīng)效率，3'端突出的雙鏈DNA要比平端或3'端縮進(jìn)的雙鏈DNA高很多。TdT催化單鏈DNA末端加dNTP的反應(yīng)效率要比雙鏈DNA高很多。在適當(dāng)?shù)臈l件下，TdT也可以催化RNA 3'末端加NTP的反應(yīng)。
本試劑盒適合標(biāo)記純化的單鏈DNA，如果用于標(biāo)記EMSA探針，可以在單鏈標(biāo)記后再進(jìn)行退火。
本試劑盒中提供了已經(jīng)用生物素標(biāo)記好的Biotin-Control Oligo，可以用作檢測(cè)DNA標(biāo)記效率的對(duì)照。
如果每個(gè)標(biāo)記反應(yīng)的探針量為5pmol，本試劑盒可以用于20個(gè)標(biāo)記反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
需自備用于檢測(cè)探針標(biāo)記效率的帶正電荷尼龍膜，以及用于生物素檢測(cè)的相關(guān)試劑。帶正電荷尼龍膜(FFN12/FFN16)可以向信裕生物訂購(gòu)。 
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 

使用說(shuō)明：
1. 準(zhǔn)備工作：
A. 取出TdT Buffer(5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上備用。
B. 取出待標(biāo)記的DNA 探針，用水稀釋至1μM，并置于冰浴上備用。
2. DNA探針的標(biāo)記： 
A. 如下設(shè)置反應(yīng)體系：

B. 用槍輕輕吹打混勻，切勿vortex。37℃孵育30分鐘。
C. 加入2.5μl探針標(biāo)記終止液，輕輕混勻終止反應(yīng)。
3. TdT的去除：
A. 探針標(biāo)記反應(yīng)終止后，加入52.5μl氯仿-(24:1)，vortex使有機(jī)相和水相充分混合以抽提TdT(說(shuō)明：靜止后有機(jī)相和水相會(huì)很快分層)。
B. 12000-14000g離心1-2分鐘。吸取上清備用。上清即為被生物素標(biāo)記的DNA探針。
4. 探針的純化(選做)：
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以不必純化標(biāo)記好的探針。有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：
A. 對(duì)于100μl標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25μl的5M醋酸銨，再加入2體積即200μl的無(wú)水乙醇，混勻。
B. -70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或-20℃沉淀過(guò)夜。
C. 4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
D. 4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過(guò)分干燥。
E. 加入50μl TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針可以-20℃保存。
5. 生物素標(biāo)記探針標(biāo)記效率的檢測(cè)：
A. 取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混勻，稀釋成10nM Biotin-Control Oligo(作為標(biāo)準(zhǔn)品)。取出適量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
B. 取3μl步驟3B所獲得的生物素標(biāo)記的DNA探針(100nM)，加入27μl TE，混勻，稀釋成10nM生物素標(biāo)記的探針(作為待測(cè)樣品)。取出適量的10nM生物素標(biāo)記的探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C. 參考下面的表格，取一適當(dāng)大小的帶正電荷尼龍膜，在膜上做好相應(yīng)標(biāo) 記。對(duì)于經(jīng)過(guò)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，分別取2μl滴加到膜上。在膜上滴加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品時(shí)，請(qǐng)注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一個(gè)濕的圓形小斑點(diǎn)。說(shuō)明：如果條件許可，可 以使用專(zhuān)門(mén)用于點(diǎn)雜交或狹縫雜交的設(shè)備進(jìn)行探針標(biāo)記效率的檢測(cè)，探針用量也參考下表，濃度 可以稀釋50倍，而所用體積可以相應(yīng)放大50倍至100μl。

D. 滴加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品后，將膜室溫晾干。
E. 用紫外交聯(lián)儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長(zhǎng)，120mJ/cm2，交聯(lián)30-45秒。如果沒(méi)有紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如信裕生物的手提紫外檢測(cè)儀，產(chǎn)品編號(hào)EUV002)，距離膜5-10厘米左右照射1-5分鐘。也可以使用超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射1-10分鐘。的交聯(lián)時(shí)間可以使用標(biāo)準(zhǔn)品自行摸索。
F. 隨后可以立即采用各種生物素檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)出樣品的生物素標(biāo)記效率；也可以室溫存放數(shù)天直至進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
G. 如果最后采用的是ECL類(lèi)試劑或其它類(lèi)似試劑進(jìn)行檢測(cè)，則可以對(duì)比樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的灰度，從而計(jì)算出探針的標(biāo)記效率。例如2fmol量的待測(cè)樣品探針的灰度和1fmol標(biāo)準(zhǔn)品的灰度相同，則說(shuō)明探針的標(biāo)記效率大致為50%，待測(cè)樣品中總探針的濃度約為1μM，而實(shí)際被生物素標(biāo)記的探針約為0.5μM。探針的標(biāo)記效率也可以通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較精確的計(jì)算。用于后續(xù)檢測(cè)時(shí)通常要求標(biāo)記效率不低于30%。有文獻(xiàn)報(bào)道標(biāo)記效率和3'末端的堿基無(wú)關(guān)，但和整個(gè)待標(biāo)記探針的序列有關(guān)。由于在TdT的催化下可以在待標(biāo)記探針的3'端加上多個(gè)Biotin標(biāo)記的dUTP，因此有時(shí)會(huì)出現(xiàn)標(biāo)記效率大于100%的情況。