PCR Kit with BeyoTaq
本PCR試劑盒帶有BeyoTaq DNA Polymerase、PCR buffer、dNTP和上樣緩沖液，自備模板和引物即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，適合用于各種常規(guī)PCR以及T載體克隆、點(diǎn)突變等，能在高效擴(kuò)增DNA模板的情況下同時(shí)保證高保真性。
BeyoTaq DNA Polymerase簡稱BeyoTaq酶，是一種兼顧了高保真性和高擴(kuò)增效率的DNA聚合酶。
BeyoTaq酶可以催化5’至3’方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合。同時(shí)BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)。另外，BeyoTaq酶有5’至3’外切酶活性，但BeyoTaq酶沒有反轉(zhuǎn)錄酶活性。
由于BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性，因此在PCR擴(kuò)增過程中出錯(cuò)的幾率大大降低，出錯(cuò)率為1.6×10-6-6 per nt per cycle，略低于Pfu酶的2.6×10-6 per nt per cycle。
BeyoTaq酶的DNA擴(kuò)增效率大大高于Pfu酶，和Taq酶的擴(kuò)增效率比較接近，很好地兼顧了擴(kuò)增效率和擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。
用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點(diǎn)突變、T載體克隆等各種常規(guī)PCR反應(yīng)。
用BeyoTaq酶擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物帶有3’-dA overhangs，可以用于基于T載體的PCR片段克隆。
BeyoTaq酶可以擴(kuò)增長度達(dá)5kb的DNA片段，最長可以擴(kuò)增長達(dá)10kb的DNA片段。通常適合擴(kuò)增3kb以下的DNA片段。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into
a polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 72℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 2 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v)glycerol。
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)：200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20mM
MgSO4, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使BeyoTaq酶失活。
試劑盒帶有dNTP，該dNTP為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，每種的濃度均為2.5mM。
本試劑盒用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個(gè)反應(yīng)，用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個(gè)反應(yīng)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-7237-1
BeyoTaq DNA Polymerase (5U/μl)
200U
XY-7237-2
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)
1ml
XY-7237-3
dNTP (2.5mM each)
0.7ml
XY-7237-4
6X DNA Loading Buffer
1ml×2
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬倍，在使用BeyoTaq酶時(shí)請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性，無dNTP時(shí)可以降解引物。因此BeyoTaq酶一定要最后加入，并且要在冰浴上操作。
不能使用Taq酶的PCR Buffer來替代Pfu酶的PCR Buffer。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
- 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
- a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將BeyoTaq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
- b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoTaq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中可以包括引物)：
雙蒸水或Milli-Q水
-
(36.75-x)μl
(14.7-y)μl
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)
1X
5μl
2μl
dNTP (2.5mM each)
0.2mM each
4μl
1.6μl
引物混合物(10μM each)
0.8μM
4μl
1.6μl
BeyoTaq DNA Polymerase (5U/μl)
1.25U/50μl
0.25μl
0.1μl
- *對于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
- c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
- d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
- e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
- 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
- STEP1(起始變性): 94℃ 3min
- STEP2(變性): 94℃ 30sec
- STEP3(退火): 55℃ 30sec
- STEP4(延伸): 72℃ 2min
- STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
- STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
- STEP7(臨時(shí)保存): 4℃ forever
- a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
- b.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1.5分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1.5分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為3分鐘，以此類推。
- c.對于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確保可以擴(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。
常見問題：
- 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
- a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
- b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
- c.超長片段擴(kuò)增。盡管BeyoTaq DNA polymerase可以擴(kuò)增較長的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增10kb以下的片段，更長片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
- d.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
- e.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
- f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
- g.延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置，對于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3分鐘。
- h.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
- i.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
- j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
- k.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
- l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
- m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
- n.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ?huì)有很大幫助。
關(guān)鍵字： PCR Kit with BeyoTaq說明書；PCR Kit with BeyoTaq
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾?，并在北京、廣東，江西，吉林等全國30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。