HemoTaq™ DNA Polymerase (Blood-resistant)
信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ DNA Polymerase (Blood-resistant),即耐血HemoTaq™ DNA聚合酶,是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的適用于EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血樣品或干血斑樣品直接PCR檢測的耐熱DNA聚合酶。
對(duì)于全血樣品可以直接PCR檢測,無須提取DNA。本產(chǎn)品對(duì)人、小鼠等全血中血紅素等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗性,對(duì)于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的人或小鼠血液樣品或者干血斑(如whatman903或FTA采血卡上的干血斑),都無需進(jìn)行DNA提取純化,可以直接用于PCR擴(kuò)增目的DNA。
所需血樣少,耐血能力高。本產(chǎn)品用于20μl的PCR擴(kuò)增體系時(shí),通常僅加入約1μl抗凝全血即可順利完成PCR檢測。用于檢測細(xì)菌、病毒等微生物感染時(shí),為獲得最高的檢測靈敏度,20μl的PCR擴(kuò)增體系中加入的血液量可以達(dá)到4μl,即20%體積,有些類型的抗凝血(例如人肝素抗凝血)加入的全血體積可以達(dá)到10μl,即50%體積。
兼容EDTA、肝素或檸檬酸鈉三種常見抗凝血。血液樣品用于PCR檢測時(shí),EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血都可以兼容的。如果希望取得的檢測效果,優(yōu)先推薦EDTA抗凝血。因?yàn)镋DTA可以螯合多種核酸酶發(fā)揮酶活性所必須的金屬離子,從而可以更好地抑制核酸的降解。
本產(chǎn)品提供了一對(duì)陽性對(duì)照引物,便于確認(rèn)PCR檢測效果。該對(duì)引物是一種人和小鼠的通用引物,可以擴(kuò)增人或小鼠基因組DNA中β-actin基因的300bp DNA片段。
本產(chǎn)品的耐血體積百分比可以達(dá)到20-50%。本產(chǎn)品用于肝素、檸檬酸鈉和EDTA抗凝血PCR檢測的效果參考圖1。圖中可見,本產(chǎn)品對(duì)肝素(heparin)、檸檬酸鈉和EDTA處理的人全血的耐受體積百分比可以達(dá)到50%、20%和30%。對(duì)于小鼠全血的PCR檢測,本產(chǎn)品可以耐受的體積百分比也不小于20%。綜上,本產(chǎn)品用于PCR檢測時(shí),推薦的全血的使用量為PCR總體積的1-20%,先的推薦用量為5-10%。
圖1.信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ DNA Polymerase擴(kuò)增圖中所示不同抗凝劑采集的人抗凝全血中目的基因的電泳效果圖。使用HemoTaq™ DNA Polymerase及本產(chǎn)品提供的Control primer mix,在PCR體系中直接加入5-50%不同體積百分比的不同抗凝劑采集的人抗凝血,用于擴(kuò)增β-actin基因的300bp DNA片段后的電泳效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
HemoTaq™ DNA Polymerase (Blood-resistant)的保真性和Taq DNA聚合酶相近,因此本產(chǎn)品建議主要用于血液檢測目的。如果目的是為了克隆特定基因,推薦使用D7243S/M HemoTaq™ HF DNA Polymerase (Blood-resistant)或者D7287S/M Easy-Load™ Blood Direct PCR Master Mix (HF, 2X)。
本產(chǎn)品可以輕松擴(kuò)增長達(dá)5kb的目的片段。本產(chǎn)品擴(kuò)增不同長度目的基因的效果參考圖2。圖中可見,HemoTaq™ DNA Polymerase以檸檬酸鈉抗凝全血為模板可以直接PCR擴(kuò)增出長達(dá)5kb的DNA片段。
圖2.信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ DNA Polymerase直接以10%檸檬酸鈉抗凝全血為模板擴(kuò)增不同長度的目的基因的效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands)); 1, β-actin (300bp); 2, CCR5 (630bp); 3, CCR5 (1100bp); 4, CCR5 (2000bp); 5, IL-6 (2841bp); 6, IL-6 (4171bp); 7, IL-6 (4882bp)。
本產(chǎn)品擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物帶有3'-dA overhangs的粘性末端,可直接用于和T載體連接進(jìn)行TA克隆。
來源:大腸桿菌重組表達(dá)純化獲得。
用途:抗凝血樣品基因組DNA中目的基因的直接擴(kuò)增、基因分型(如基因缺失等)、血液樣品中細(xì)菌、病毒等微生物感染的基因檢測,以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠基因型分析。
純度:不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶,不含RNA酶,滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v) Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
失活或抑制:酚氯仿抽提可以使HemoTaq™ DNA Polymerase失活。
本產(chǎn)品如果用于50微升的PCR反應(yīng)體系,兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于80個(gè)和400個(gè)反應(yīng);如果用于20微升的PCR反應(yīng)體系,兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于200個(gè)和1000個(gè)反應(yīng)。
包裝清單:
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-7241S-1
HemoTaq™ DNA Polymerase
200μl
XY-7241S-2
10X HemoTaq™ PCR Buffer
400μl
XY-7241S-3
Control primer mix (10μM each)
50μl
保存條件:
-20℃保存。
注意事項(xiàng):
由于PCR反應(yīng)非常靈敏,在使用HemoTaq™ DNA Polymerase時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染,并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
設(shè)置PCR反應(yīng)體系時(shí),抗凝血的推薦用量為PCR體系總體積的5-10%左右,可以直接添加到PCR體系中,無需進(jìn)行任何額外處理。
PCR反應(yīng)結(jié)束之后,建議3000-5000g離心3-5min以沉淀血細(xì)胞碎片,便于吸取上清用于電泳分析等。注意:由于抗凝血本身的原因,PCR結(jié)束后在PCR管底部會(huì)出現(xiàn)透明凝膠狀物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象。
需自備dNTP和Nuclease-Free Water。推薦選購信裕生物生產(chǎn)的D7371 dNTP Mixture (2.5mM each)或D7373 dNTP Mixture (25mM each),以及ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置:
a.融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將HemoTaq™ DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系(如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng),可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和HemoTaq™酶的混合物,然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況,有時(shí)混合物中也可以包括引物):
Nuclease-Free Water
(14-x)μl
(35-y)μl
-
10X HemoTaq™ PCR Buffer
2μl
5μl
1X
dNTP (2.5mM each)
2μl
5μl
0.25mM each
Control primer mix (10μM each)
1μl
2.5μl
0.5μM each
HemoTaq™ DNA Polymerase
1μl
2.5μl
-
注意:
(a)模板使用量:作為PCR模板的抗凝血用量一般為PCR反應(yīng)體系總體積的1-20%,建議起始使用量為5%。如果PCR反應(yīng)用于檢測基因組的DNA片段,可以適當(dāng)減少抗凝血用量;如果用于檢測血液樣品中某種病毒或細(xì)菌等微生物的目的DNA片段,建議使用50μl的PCR體系,并使用較大的模板血量。對(duì)于高GC含量的PCR擴(kuò)增,可以使用擴(kuò)增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X),或者嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。對(duì)于干血斑樣品,20μl和50μl的PCR體系中分別推薦使用約0.8平方毫米和2平方毫米的干血斑。
(b)引物濃度:通常引物的終濃度為0.5μM時(shí)可獲得良好的檢測效果,也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),可降低引物濃度。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻,室溫離心數(shù)秒,使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋,則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上,開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格:
步驟
循環(huán)數(shù)
溫度
時(shí)間
說明
4
-
4℃
長時(shí)間保持
臨時(shí)存放
注意:
a.起始變性(94℃,5min)可以使白細(xì)胞裂解,釋放出可用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。
b.需根據(jù)每次反應(yīng)的模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等適當(dāng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR,為盡量確??梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物,可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。
常見問題:
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中,一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下,可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。向PCR體系中加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X),并相應(yīng)地根據(jù)其要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
c.目的片段過長。盡管HemoTaq™ DNA Polymerase可以擴(kuò)增最長達(dá)5kb的DNA片段,但大多數(shù)時(shí)候更適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段。對(duì)于過長的目的片段的擴(kuò)增,需要適當(dāng)優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)參數(shù)。
d.引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體或引物偏短會(huì)導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火,通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法,使退火更加充分。
e.退火溫度不佳,需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀,則可以設(shè)置退火的溫度梯度,摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀,則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f.延伸時(shí)間不足。可按照每1kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置,對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3-4分鐘。
g.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
h.循環(huán)數(shù)不足,適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40,常用的循環(huán)數(shù)范圍為30-40。
i.模板用量偏少,可以在耐血體積范圍內(nèi)適當(dāng)加大樣品用量,或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物,然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增,這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用,同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增,可以起到擴(kuò)增作用,但不能去除非特異性條帶。
j.對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
l.適當(dāng)增加HemoTaq™ DNA polymerase的用量。
m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí),可以適當(dāng)提高退火溫度。
n.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有很大幫助。
o.確保沒有漏加任何PCR組分。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少抗凝全血的用量。
c.在室溫配制PCR體系容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系。
d.適當(dāng)減少HemoTaq™ DNA Polymerase的用量,加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X)。
e.適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。
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上海康朗生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè),專營生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué),分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品??偛课挥谏虾#⒃诒本?、廣東,江西,吉林等全國30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦,上海交大,復(fù)旦醫(yī)學(xué)院,上海中醫(yī)藥大學(xué),華東師范大學(xué),第二軍醫(yī)大學(xué),曙光醫(yī)院,浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用,可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。