一步式染料法qRT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板和引物即可進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR反應(yīng)，具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 以 2×Mix 提供，用戶只需準(zhǔn)備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，非常方便快捷，降低了操作誤差。

2. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應(yīng)的靈敏度高，特異性強(qiáng)。靈敏度最高時(shí)可以達(dá)到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)等相關(guān)）。

3. 靈敏度和專一性比常規(guī) RT-PCR 更高。

4. 可用于基因表達(dá)分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實(shí)驗(yàn)。也可以用于定性檢測。

5. 本產(chǎn)品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 塑料袋包裝 
2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 190102a 500 uL（橙色蓋）
10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 190102b 100 uL（紅色蓋）
使用手冊 190102sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 不凍融時(shí)保存期限為 12 個(gè)月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。

自備試劑 RNA 模板、引物、超純水。

使用方法

1. 如果有 N 個(gè)樣品并且做定量分析，設(shè)置 N+7 個(gè)反應(yīng)，多出的 7 個(gè)中，6 個(gè)是做標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性對照，一個(gè)是陰性對照（NC）。在 N+7 個(gè) PCR 管中，加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個(gè)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品縮減成一個(gè)陽性對照（PC），用戶自己需要根據(jù)下

表進(jìn)行適當(dāng)修改（把 6 個(gè)標(biāo)曲

自備 50×ROX I 染料

或

自備 50×ROX II 染料（見注）

各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL

10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL

補(bǔ)超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準(zhǔn)。

1、不需要 ROX 的機(jī)型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號(hào)的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會(huì)影響整個(gè) PCR 分析。

2、需要使用 ROX I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、StepOne Plus。

3、需要使用 ROX II 的機(jī)型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。

2. 放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 下表的擴(kuò)增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長度，引物的 Tm 值等進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法 PCR：

步驟 反應(yīng)參數(shù) 備注

逆轉(zhuǎn)錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘

預(yù)變性 94℃ 2 分鐘

PCR（35-45 次循環(huán)）

94℃ 15 秒

55-65℃ 15-30 秒

在此步采集 FAM 通道的

熒光信號(hào)

72℃ 30 秒

如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以選擇兩步法 PCR：

步驟 反應(yīng)參數(shù) 備注

逆轉(zhuǎn)錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘

預(yù)變性 94℃ 2 分鐘

PCR（35-45 次循環(huán)）

94℃ 15 秒

60℃ 30-60 秒

在此步采集 FAM 通道的

熒光信號(hào)

3. 數(shù)據(jù)處理如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在5-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。