可調(diào)式易錯PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點易錯 PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2存在）能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫選出所需突變體。易錯 PCR 和常規(guī) PCR的比較如下：

本產(chǎn)品是在本公司的易錯 PCR 試劑盒基礎(chǔ)上改進(jìn)而得，本產(chǎn)品具有下列特點：

1. 即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的優(yōu)越性。

2. 配方經(jīng)過精心優(yōu)化，實驗人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率，一輪 PCR 的突變率范圍在 2-8突變/1000bp，更高的突變率可以通過多輪 PCR 達(dá)到。

3. 可用于連續(xù)易錯 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯 PCR 的產(chǎn)物用作下一次易錯 PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

4. 可以擴(kuò)增的 DNA 片段更長，達(dá)到 2kb，對于 2kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

5. 本試劑盒足夠 100 次 30uL 體系的易錯 PCR。

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年。 

自備試劑 引物、DNA 模板、常規(guī) PCR 試劑盒。

使用方法

1. 將引物稀釋到 10uM。引物也是決定易錯 PCR 成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計引物時要保證其 Tm在 70℃，長度在 25-30nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3 端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2. 用自備易錯 PCR 引物和常規(guī) PCR 試劑擴(kuò)增制備易錯 DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物），膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意：易錯 PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物，因為膠回收會可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯 PCR 引物擴(kuò)增所得，在易錯 PCR 擴(kuò)增時也會擴(kuò)增，產(chǎn)生競爭抑制，降低靶分子的擴(kuò)增效率。如果常規(guī) PCR 制備模板的引物和易錯 PCR 引物不同（類似巢式 PCR）則可以避免此問題，但需要合成兩對引物。

3. 將回收的 DNA 片段（模板）稀釋到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板 DNA 為非突變 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)生的 DNA 為突變 DNA，易錯 PCR 體系最終 DNA 量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在終產(chǎn)物中的相對比例就越低，突變率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易擴(kuò)增成功，所以建議同時測試兩個模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析。

4. 根據(jù)每 1000bp 的預(yù)期突變數(shù)按下表確定 30uL 易錯 PCR 體系中 MnCl2和 dGTP 的用量（這是在模板DNA不超過1ng的前提下的數(shù)據(jù)）。表中的Mn表示易錯PCR專用的MnCl2,dG 表示易錯 PCR 專用的 dGTP：

預(yù)期突變數(shù) 2 個 3 個 4 個 5 個 6 個 7 個 8 個

Mn 用量（uL） 0 1.0 2.5 4.0 4.0 4.0 4.0

dG 用量（uL） 0 0 0 1.0 2.0 3.0 4.0

5. 一次建議設(shè)置 3 個模板濃度。在 3 干凈的 PCR 管中，分別加入下列成分（這里是設(shè)置30uL 的反應(yīng)體系，如果反應(yīng)體系不是 30 uL，則各成分用量需要按等比例增加或減少）：

成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3

易錯 PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL

易錯 PCR 專用 dNTP,

10×

3 uL 3 uL 3 uL

易錯 PCR 專用 MnCl2 根據(jù)上步計算 根據(jù)上步計算 根據(jù)上步計算

易錯 PCR 專用 dGTP 根據(jù)上步計算 根據(jù)上步計算 根據(jù)上步計算

自備 DNA 模板 1 uL 1 uL 1 uL

（1ng/uL） （10ng/uL） （100ng/uL）

自備 PCR 引物

(10 uM each) 1 uL each 1 uL each 1 uL each

易錯 PCR 專用

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL

超純水 補(bǔ)水到 30uL 補(bǔ)水到 30uL 補(bǔ)水到 30uL

6. 按已經(jīng)優(yōu)化的常規(guī) PCR 條件進(jìn)行易錯 PCR：

PCR 前變性 94℃ 3 分鐘

易錯 PCR(循環(huán) 30-60 次)

94℃ 1 分鐘

45℃ 1 分鐘

72℃ 1 分鐘（對 1Kb 長的模板）

注：易錯 PCR 一般不需要熱啟動，也不需要在 PCR 結(jié)束后做延伸處理。長度每增加 1Kb，時間延長 1分鐘。易錯 PCR 循環(huán)次數(shù)越多，突變 DNA（擴(kuò)增產(chǎn)物）與非突變 DNA（模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴(kuò)增次數(shù)越多，發(fā)生突變的數(shù)就越高，在同一模板上發(fā)生的突變位點數(shù)就越多，所以一次實驗時好做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 個循環(huán)數(shù)的比較。

7. 電泳檢測是否得到預(yù)計長度的 PCR 產(chǎn)物。如果沒有，可以調(diào)整模板用量和 PCR 參數(shù)。

8. 膠回收易錯 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆并對單菌落進(jìn)行功能篩選或測序分析、如果需要增加突變率，可以以突變后的 DNA 為模板，進(jìn)行下一輪易錯 PCR。