即用型易錯PCR試劑盒
產品特點：制突變PCR易錯 PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2存在）能夠按較高的機率引入隨機引入突變。如果有適當?shù)倪x擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體。易錯 PCR 和常規(guī) PCR 的比較如下：本產品就是專門為廣大的研究工作者進行易錯 PCR 而開發(fā)，本產品具有下列特點：

1. 即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學研究領域顯示出了它的優(yōu)越性。

2. 配方經(jīng)過精心優(yōu)化，突變率穩(wěn)定，突變沒有趨向性。易錯 PCR 的突變率為 0.66%（±0.13%），詳見使用手冊疑難解答。

3. 比體內基因突變更快捷簡單，但如果在 PCR 引物中設計位點，則可使產物克隆到表達載體，也可以用于體內蛋白活性的篩選。

4. 可用于連續(xù)易錯 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯 PCR 的產物用作下一次易錯 PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。

5. 只適用于擴增 1kb 以下的產物，對于 1kb 以上的產物，建議分段擴增。

6. 本產品足夠 100 次 30uL 體系的易錯 PCR 反應，只能用于科研。
即用型易錯PCR試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編 號 十孔盒包裝
易錯 PCR Mix，10× 101005a 300 uL（白蓋）
易錯 PCR 專用 dNTP，10× 101005b 300 uL（綠蓋）
易錯 PCR 專用 MnCl2 160903c 300 uL（黃蓋）
易錯 PCR 專用
Taq DNA 聚合酶（5U/uL）
101005c 50 uL（紅蓋）
使用手冊 101005sc 1 份

即用型易錯PCR試劑盒運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年。 

自備試劑 引物、DNA 模板、超純水。

使用方法 1. 將自備的 PCR 引物稀釋到 10uM。引物也是決定易錯 PCR 成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其 Tm 在 70℃，長度在 25-30nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結構。用自備引物和常規(guī) PCR 試劑擴增制備易錯 DNA 模板（常規(guī) PCR 產物），膠回收并準確確定濃度。注意：易錯 PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產物，因為膠回收會可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯 PCR引物擴增所得，在易錯 PCR 擴增時也會被擴增，產生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。如果常規(guī) PCR 制備模板的引物和易錯 PCR 引物不同（類似巢式 PCR）則可以避免此問題，但需要合成兩對引物。本試劑盒只適用于擴增 1kb 以下的產物，對于1kb 以上的產物，建議分段擴增。

2. 將回收的 DNA 片段（模板）稀釋到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三個濃度。

注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板 DNA 為非突變 DNA，擴增產生的 DNA 為突變 DNA，易錯 PCR 體系最終 DNA 量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在終產物中的相對比例就越低，突變率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易擴增成功，所以建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產物進行分析。

3. 以 30 uL 的標準 PCR 反應體系為例，如果反應體系不是 30 uL，各成分需要等按比例增加或減少。在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分：成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3

易錯 PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL

自備 DNA 模板 1 uL（1ng/uL）1 uL（10ng/uL）1 uL（100ng/uL）

易錯 PCR 專用 dNTP,10×3 uL 3 uL 3 uL

易錯 PCR 專用 MnCl2 3 uL 3 uL 3 uL自備易錯 PCR 引物(10 uM each)各 1 uL 各 1 uL 各 1 uL

易錯 PCR 專用 Taq

DNA 聚合酶（5U/uL）

0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL

補自備超純水到 30 uL 30 uL 30 uL

4. 按用戶已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 條件進行一定循環(huán)數(shù)的 PCR（循環(huán)數(shù)與突變率的關系見下表），然后取 10uL 電泳檢查。如果沒有優(yōu)化的 PCR 條件，一般可以先嘗試下面的PCR 條件(注意：易錯 PCR 一般不需要熱啟動，也不需要在 PCR 結束后做延伸處理)：

步驟 參數(shù) 循環(huán)數(shù)

PCR 前變性 94℃ 3 分鐘 循環(huán) 1 次

易錯 PCR

94℃ 1 分鐘

45℃ 1 分鐘 循環(huán) 30-60 次

72℃ 1 分鐘

注：易錯 PCR 一般不需要熱啟動，也不需要在易錯 PCR 結束后做延伸處理。易錯 PCR

循環(huán)次數(shù)越多，突變 DNA（擴增產物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外

在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數(shù)越多，發(fā)生突變的絕對數(shù)就越高，在同一模

板上發(fā)生的突變位點數(shù)就越多，所以如果需要，可以做 30、35、40、45、50、55、60

次 7 個循環(huán)數(shù)的比較。

5. 電泳檢測是否得到預計長度的 PCR 產物。如果沒有，可以調整模板用量和 PCR 參數(shù)。

6. 膠回收易錯 PCR 擴增產物、克隆并對單菌落進行功能篩選或測序分析、如果需要增加突變率，可以以突變后的 DNA 為模板，進行下一輪易錯 PCR。